1、环氧化酶 2 抑制剂预防大鼠化学性乳腺癌【摘要】 目的： 观察环氧化酶2 (COX2) 选择性抑制剂塞来昔布对化学致癌剂 7，12 二甲基苯蒽（DMBA）化学诱发的大鼠乳腺癌形成的影响. 方法： DMBA 油剂灌胃复制大鼠乳腺癌模型，90 只大鼠分为 3 组，单纯诱癌组作为阴性对照、三苯氧胺组作为阳性对照、观察塞来昔布对大鼠乳腺肿瘤发生率和 bcl2, VEGF 蛋白表达的影响. 结果： 三苯氧胺组（48.2%）和塞来西布组（50.0%）肿瘤发生率低于单纯诱癌组（85.7%，分别为 P=0.003，P=0.004）. 塞来昔布组 VEGF 蛋白表达率（42.9%）低于单纯诱癌组（79.2%，P
2、=0.023） ，和三苯氧胺组（46.2%）无差异（P=0.863）. 塞来昔布组 bcl2 蛋白表达率（42.9%）低于单纯诱癌组（83.3%，P=0.010） ，低于三苯氧胺组（53.9%） ，但无差异（P=0.568）. 结论： 塞来昔布能抑制 DMBA 诱发的大鼠乳腺癌的发生、发展，下调 bcl2 和 VEGF 蛋白表达可能是其机制之一. 【关键词】 乳腺肿瘤 化学预防 三苯氧胺 塞来昔布 环氧化酶2 0 引言 环氧化酶(cyclooxygenase，COX)参与维持机体各种生理和病理过程. COX1 是一种结构酶，它催化产生的 PG 参与机体正常生理过程和保护功能，COX2 被认为是
3、诱导型酶，只在病理情况下才表达，包括炎症、损伤、修复及肿瘤的生长和转移. 许多癌前病变和恶性肿瘤均有 COX2 基因扩增和蛋白的高表达，有效抑制 COX2 的表达可能对肿瘤发生、发展具有重要意义1-2. 本研究在用化学致癌剂 7，12 二甲基苯蒽(7，12dimethylbenz anthracene，DMBA)诱发大鼠乳腺癌的过程中，观察 COX2 特异性抑制剂塞来昔布对 DMBA 化学诱发的乳腺癌形成及bcl2 及 VEGF 蛋白表达的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 实验用未交配雌性 SD 大鼠 90 只，鼠龄（455）d，体质量（11010）g，以 DMBA 油剂 200 mg/k
4、g 灌胃复制大鼠乳腺癌模型. 每组30 只大鼠，分为单纯诱癌组（造模后正常饮食）作为阴性对照、三苯氧胺组（饮用水加入 4 mg /kg 三苯氧胺，正常饮用）作为阳性对照、塞来昔布组（饲料加入 1000 mg/kg 塞来昔布，用玉米油溶解后，拌于正常饲料内喂养）. 观察各组大鼠进食、毛发、排泄情况，并每周两次检测大鼠乳腺. 1.2 方法 于实验的第 120 日停药，经阴道涂片检查，证实为间情期，以 50 g/L 乌拉坦液腹腔注射麻醉，将每个乳腺连同周围皮肤、皮下组织解剖，自乳头部对半切开乳腺进行大体观测，计数肿瘤数量及形态，标本固定于 40 g/L 甲醛溶液中，常规石蜡包埋，HE 染色. 乳腺癌
5、诊断参考实验性大鼠乳腺癌分类诊断标准3. 免疫组化 SP 法检测 bcl2 和 VEGF 蛋白表达： 4 m 石蜡切片，二甲苯常规脱蜡，梯度酒精水化，30 g/L H2O2 甲醇室温下封闭，微波炉修复抗原，非免疫性羊血清以阻断组织中非特异性吸附，滴加兔抗鼠bcl2 ，VEGF 多克隆抗体(1100)，湿盒内 4冰箱过夜，滴加生物素标记的二抗 IgG，滴加辣根过氧化酶标记的链霉卵白素工作液，DAB 显色，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片. 以细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，阳性判定标准：无阳性染色；，弥散弱的胞浆染色， 染色细胞数10； ，中等至强的胞浆染色， 阳性细胞数介于1050；
6、，50以上的细胞强染色. 统计学处理： 统计学检验采用 SPSS 10.0 软件进行， P0.05 为有显著性差异. 2 结果 实验结束前死亡大鼠未纳入实验结果统计，实验结束时每组有完整数据的大鼠数为：单纯诱癌组 28 只，三苯氧胺组 27 只，塞来昔布组 28只. 2.1 单纯诱癌组、三苯氧胺组和塞来昔布组乳腺癌发生率 单纯诱癌组 24 只大鼠发生乳腺癌，发生率为 85.7（24/28） ；三苯氧胺组 13 只大鼠发生乳腺癌，发生率 48.2%（13/27） ；塞来昔布组 14 只大鼠发生乳腺癌，发生率 50.0（14/28） ；三苯氧胺组、塞来昔布组乳腺癌发生率低于单纯诱癌组(28.811
7、， P=0.003；28.187， P=0.004)；三苯氧胺组与塞来昔布组的乳腺癌发生率无显著性差异(20.019， P=0.891). 2.2VEGF 蛋白在乳腺癌组织中的表达 VEGF 蛋白的阳性染色颗粒位于乳腺癌细胞的胞浆内，部分内皮细胞可见阳性着色，塞来昔布组（图 1A）与单纯诱癌组（图 1B）比较，VEGF蛋白的表达明显减弱. VEGF 蛋白在 3 组肿瘤组织中的表达为，3 组之间阳性表达率差异有统计学意义(2=6.457，P=0.040)；塞来昔布组 VEGF蛋白阳性表达率低于单纯诱癌组，差异有统计学意义（2=5.179，P=0.023） ；塞来昔布组 VEGF 蛋白阳性表达率与
8、三苯氧胺组无统计学差异（2=0.030，P=0.863）. 三苯氧胺组和单纯诱癌组VEGF 蛋白阳性表达率有统计学差异（2=4.194，P=0.041，表 1）.表1VEGF 和 bcl2 蛋白在单纯诱癌组、三苯氧胺组、塞来昔布组乳腺癌组织中的表达(略) 2.3bcl2 蛋白在乳腺癌组织中的表达 bcl2 蛋白的阳性染色颗粒位于乳腺癌细胞的胞浆内，部分内皮细胞可见阳性着色，塞来昔布组（图 2A）与单纯诱癌组（图 2B）比较，bcl2 蛋白的表达明显减弱. bcl2 蛋白在 3 组肿瘤组织中的表达为，塞来昔布组 bcl2 蛋白阳性表达率低于单纯诱癌组，差异有统计学意义（2=6.705，P=0.0
9、10） ；塞来昔布组 bcl2 蛋白阳性表达率与三苯氧胺组无统计学差异 （2=0.326， P=0.568） ； 三苯氧胺组 bcl2 蛋白阳性表达率低于单纯诱癌组， 但无统计学差异（2=3.718， P=0.054, 表 1）. 3 讨论 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，三苯氧胺是乳腺癌预防和治疗的一线用药和金标准. 许多癌前病变和恶性肿瘤中均有 COX2 基因的扩增和蛋白的高表达，有效抑制 COX2 的表达对预防肿瘤发生发展有重要意义. 本研究采用三苯氧胺作为阳性对照，在大鼠化学性乳腺癌的发生过程中，观察塞来昔布对大鼠乳腺癌形成的影响，并探讨其抗肿瘤形成的机制. 本研究发现，塞来昔布组乳
10、腺肿瘤发生率明显低于单纯诱癌组，表明塞来昔布能有效抑制 DMBA 诱发的大鼠化学性乳腺癌的发生、发展，对乳腺癌高危人群预防具有潜在的应用价值. 其他学者也有类似报道， Harris 等4用塞来昔布处理 DMBA 诱导的乳腺癌模型，发现塞来昔布能明显延迟肿瘤的发生，与优布芬相比更加有效. 饲料内混入塞来昔布乳腺癌的发生率，多发率及肿瘤体积，较对照组低. COX2 参与肿瘤的发生发展的机制尚不完全清楚，可能包括：刺激增殖、抑制凋亡、抑制免疫机能、参与前致癌物的代谢等途径. COX2 过度表达可剌激肿瘤新生血管的形成，但其机制尚未完全明确，其直接产物 PGE2 能直接刺激血管生成；同时， PGE2
11、能诱导组织生成 VEGF，产生的 VEGF 以旁分泌和自分泌的形式作用于内皮细胞，从而促进血管形成. 本研究发现，在塞来昔布处理的肿瘤组织中，VEGF 蛋白的表达水平明显低于单纯诱癌组，表明作为 VEGF 的上调因子，抑制 COX2 的表达和活性可明显下调 VEGF 的表达，两者具有明显的相关性. 人结肠癌细胞株转染 COX2 基因发现肿瘤细胞在过度表达 COX2 的同时促血管生成因子VEGF, bFGF, PDGF, 内皮素等均明显上调 ,并促进人脐静脉内皮细胞株增殖并形成网状的内皮细胞条索5. Chang 等6的研究也认为COX2 诱导的乳腺癌发生发展和 PGE2 依赖的的肿瘤新血管生成关
12、系密切. 谯敏等7发现以 COX2 为靶向的 RNA 干扰显著抑制胃癌细胞生长,可能与下调 COX2 基因表达和诱导细胞凋亡有关，这些均说明 COX2 能刺激肿瘤新血管生成，而下调 VEGF 表达是特异性 COX2 抑制剂塞来昔布的抗肿瘤机制之一. Celecoxib 抑制细胞凋亡的机制还不完全清楚，包括增加 bcl2 表达、减弱 NO 信号途径和阻断 AKT 磷酸化等途径. bcl2 是主要的抗凋亡和抗氧化蛋白，COX2 可上调 bcl2 蛋白表达，同时下调凋亡蛋白 bax和 bclXL 的表达8. 本研究发现塞来昔布处理后的肿瘤组织细胞的bcl2 表达在蛋白水平上明显低于对照组，差异具有显
13、著性，表明通过下调 bcl2 的表达、诱导凋亡产生是塞来昔布的抗肿瘤机制之一. 我们的研究表明，选择性 COX2 抑制剂塞来昔布可以有效预防大鼠乳腺癌的发生，机制可能与下调 VEGF 和 bcl2 蛋白表达有关. 【参考文献】 1Masferrer JL, Leahy KM, Koki AT, et al. Antiangiogenic and antitumor activities of cyclooxygenase2 inhibitorsJ. Cancer Res,2000,60(5):1306-1311. 2刘江伟，李开宗，窦科峰，等. 胰腺癌组织 survivin 和COX2 表达的
14、相关性J. 第四军医大学学报,2004,25(7):635-636. 3Russo J, Russo I. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary glandJ. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2000,5(2):187-200. 4Harris RE, Alshafie GA, AbouIssa HM, et al. Chemoprevention of breast cancer in rats by celecoxib, a cyclooxygenase 2 inh
15、ibitonJ . Cancer Res, 2000,60(8):2101-2103. 5Tsujii M, Kawano S, Tsuji S, et al. Cyclooxygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cellsJ. Cell, 1998, 93(5): 705-716. 6Chang SH, Liu CH, Conway R, et al. Role of prostaglandin E2dependent angiogenic switch in cyclooxygenase 2induced breast
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