1、环维黄杨星 D 对大鼠在体回肠的作用及其机制【摘要】 目的：探讨中药单体环维黄杨星 D（CVBD ）对大鼠在体回肠的作用及其机制. 方法：经十二指肠插管给予不同浓度的 CVBD ，观察 CVBD 对回肠收缩的影响，并分离培养大鼠回肠平滑肌细胞，应用钙敏感的荧光指示剂 Fura2, 于荧光分光光度计上测定平滑肌细胞内游离钙离子浓度（Ca2+i）. 结果：给药组在给予 CVBD 110 min 以后大鼠回肠的收缩幅度增强，而预先给予钙通道阻滞药硝苯地平可拮抗其对回肠的收缩作用. 当回肠平滑肌细胞悬液细胞外钙（Ca2+o）为1.5 mmol/L 时，CVBD 可诱发静息期Ca2+i 升高，而预先给予
2、维拉帕米可以抑制Ca2+i 的升高，抑制率为 17.9%；当Ca2+o 为零时，CVBD 仍可使Ca2+i 升高，而普鲁卡因对Ca2+i 升高的抑制率达29.2%. 结论：大鼠回肠平滑肌受 CVBD 刺激后，回肠的收缩幅度明显增加，作用机制可能与增加肠平滑肌细胞Ca2+i 有关，而Ca2+i增加主要来源于细胞外 Ca2+经电压依赖性钙离子通道内流及肌浆网雷诺定（ryanodine）敏感的贮存 Ca2+释放. 【关键词】 环维黄杨星 D 回肠 平滑肌细胞 IP3 受体 0 引言 环维黄杨星 D 又称黄杨宁、环常绿黄杨碱 D、黄杨碱等，从黄杨木中提取的黄杨碱，是我国近年研制成功的一种治疗心血管疾病
3、的新药，尤其作为一种非苷类强心药受到普遍关注，但是 CVBD 对于肠道的作用尚未见报道. 本实验室前期的研究工作已经证实1 ，广西桂林产小叶黄杨叶提取物对豚鼠离体回肠有明显的收缩作用，对于治疗腹胀气有研究价值. 本次实验进一步研究 CVBD 对大鼠在体回肠的作用，并分离培养出大鼠的回肠平滑肌细胞，从细胞水平上探讨 CVBD 的作用机制，为其临床应用提供进一步的依据. 1 材料和方法 1.1 材料 Wistar 大鼠，雌雄不拘，体质量(25030) g,军事医学科学院动物中心二级动物房供应，合格证号：SCXK( 军)2002001. CVBD ：河南开封开抗药业有限公司；胶原酶型、DMEM 高糖
4、培养基：美国 Gibco 公司；链霉蛋白酶 E 型：德国罗氏公司；Fura2/AM 、牛血清白蛋白（BSA）：美国 Sigma 公司；胎牛血清：美国 Hyclone 公司；免疫组化一抗：鼠源 aactin mAb, LAB VISION 公司；免疫组化二抗：SP小鼠通用试剂盒，天津联星试剂公司；即用型 SABC 免疫组化染色试剂盒：天津联星试剂公司；其余均为国产分析纯试剂. 1.2 方法 1.2.1CVBD 对大鼠在体回肠的作用实验分为 5 组：生理盐水组（4 mL/kg） 、CVBD 高、中、低剂量组（15, 5, 2 mg/kg） 、硝苯地平组（2.7 mg/kg 硝苯地平15 mg/kg
5、 CVBD ）,每组 8 只. 大鼠禁食不禁水24 h，背部皮下麻醉，仰卧位固定于手术台. 开腹暴露十二指肠，向其内插入一橡胶导尿管以备给药；然后将肠系膜较长的一段回肠（约 78 cm）引入营养液浴槽，浴槽定位于恒温水浴缸内，并向浴槽内倒入 37 KH 营养液，通以 950 mL/L O2 和 50 mL/L CO2 的混合气体；最后在回肠上选择两点（相距约 1.5 cm）, 一点固定在肠管固定棒的下端 , 另一点用与微拉力传感器连接的蛙心夹夹住，传感器(负荷 2 g)与 BL410 生物机能实验系统连接. 1.2.2 给药与指标的记录待肠管活动趋于平稳后, 各组分别经十二指肠插管给予相应药物
6、. 计算各剂量组给药 30, 60, 90, 110, 120, 130, 140, 150 min 后 3 min 内与给药前 3 min 内回肠收缩幅度均值的比值，分析不同给药组与对照组、硝苯地平组与高剂量 CVBD 组的差异. 1.2.3 大鼠回肠平滑肌细胞的分离与培养分离回肠平滑肌细胞参考Pacaud 方法加以改进2. 取大鼠（150 g）脱颈椎处死，快速自回盲部上 2 cm 取回肠 10 cm，置于冰生理盐水中，沿肠系膜将肠段剖开，轻柔洗净. 移入含 3105 U/L 青霉素及链霉素的 Dhanks 液中浸泡 30 min，钝性刮去黏膜及浆膜层. 将平滑肌层组织剪成 1 mm1 mm
7、1 mm碎块，于终浓度含胶原酶 1.2 g/L, 链霉蛋白酶 E 0.2 g/L, BSA 3 g/L 的消化液中 37振荡消化，分次消化、收集细胞（第一次消化后的上清弃去） ，至组织全部被消化. 将各次所得的上清液过 100 目细胞筛网，离心（800 r/min, 5 min） ，弃上清，最后以含 200 mL/L 胎牛血清的高糖 DMEM 培养液重悬细胞，细胞长至致密单层即可传代. 回肠平滑肌细胞要进行平滑肌肌动蛋白 aactin 免疫组织化学染色进行鉴定. 1.2.4Fura2/AM 负载及平滑肌Ca2+i 的测定将贴壁生长的传代平滑肌细胞消化下来，制备成细胞悬液，加入溶于 DMSO 的
8、 Fura2/AM (终浓度为 5 mol/L) ，恒温 37振荡 50 min. 采用日本岛津 RF510型荧光分光光度计测定平滑肌细胞Ca2+i，因为同一批培养出来的细胞具有同质性，不同剂量组分别设有 6 组同质的细胞悬液. 统计学处理: 实验所得数据以 xs 表示，统计分析软件为 SPSS 13.0. 组间均数的比较用单因素方差分析及 LSDt 检验，P0.05 为有统计学差异. 2 结果 2.1 大鼠在体回肠实验经十二指肠给予不同浓度 CVBD ，在不同时间点观察回肠的收缩幅度，经多因素方差分析 P0.05，即随着时间延长回肠收缩幅度升高更为显著，并且高、中、低剂量 CVBD 组之间具
9、有剂量依赖性. 结果显示，110 min 后大鼠回肠的收缩幅度开始升高，给药后 130, 140, 150 min 收缩幅度则高于对照组. 硝苯地平组 110 min 后回肠收缩幅度低于高剂量组（图 1）. 图 1 环维黄杨星 D(CVBD) 作用于大鼠回肠的收缩幅度趋势图 2.2 回肠平滑肌细胞形态学观察倒置显微镜下,新分离的回肠平滑肌细胞呈长短不一的梭形或椭圆形，核位于细胞中央. 图 2A 为贴壁生长 3 d 的回肠平滑肌细胞，胞质向外伸出长短不一的突起，大多细胞有 23 个突起；图 2B 为生长 14 d 的平滑肌细胞，呈典型的峰谷样生长形式. 免疫细胞化学检测结果显示：平滑肌细胞呈梭形
10、或多角形，胞质内可见棕色及浅棕色细颗粒，呈阳性反应，而核不着色，呈浅蓝色(图 2C). 可见培养的平滑肌细胞纯度较高，几乎无成纤维细胞混杂. A: 培养 3 d 100; B: 培养 10 d 100; C: 免疫组织化学染色鉴定 200. 图 2 回肠平滑肌细胞形态学观察 2.3 回肠平滑肌细胞Ca2+i 的测定当Ca2+o 为 0 mmol/L 时，大鼠回肠平滑肌细胞静息Ca2+i 为(72.58.53) nmol/L，给予乙酰胆碱 10 mol/L 则使Ca2+i 升高,而给予 CVBD 0.1, 1, 10 mol/L 后Ca2+i 分别增高 19.6%, 45.2%, 66.5%；当
11、Ca2+o 为1.5 mmol/L 时，静息Ca2+i 为(106.811.63) nmol/L，给予乙酰胆碱后Ca2+i 升高，而给予 CVBD 0.1, 1, 10 mol/L 后Ca2+i分别增高 20.8%, 49.6%, 75.3%（表 1）. 2.4 多种阻断药对 10 mol/L CVBD 诱导的外钙内流的影响当Ca2+o 为 1.5 mmol/L 时，预先给予 5 mol/L 维拉帕米孵育 5 min再给予 10 mol/L CVBD ，则显著抑制 CVBD 诱导的Ca2+i 升高(137.37.84) nmol/L，抑制率为 17.9%；而预先给予 1 mol/L 阿托品，则
12、发现Ca2+i 变化无统计学差异(164.010.1) nmol/L. 2.5 多种阻断药对 10 mol/L CVBD 诱导的内钙释放的影响当Ca2+o 为 0 mmol/L 时，预先给予 5 mmol/L 肝素孵育 5 min 再给予10 mol/L CVBD ，发现Ca2+i 变化无统计学差异(110.38.2) nmol/L；而预先给予 10 mmol/L 普鲁卡因，则能够显著抑制 CVBD 引起的Ca2+i 升高(85.510.0) nmol/L，抑制率达 29.2%. 3 讨论 据中药大辞典记载，中药黄杨还可于治疗胸腹胀气，但目前对于该药的胃肠道动力作用报道较少. 为了开发一种新的
13、胃肠动力中药，本实验对 CVBD 进行了抗腹胀气的深入研究. 通过改良的悬吊法模拟大鼠在体回肠内环境，观察 CVBD 对回肠收缩的影响. 实验结果显示，CVBD 经过 110 min 的吸收过程后，确实具有促进肠道收缩的作用. 本实验还发现，硝苯地平能够显著降低肠道的收缩幅度，阻断 CVBD 收缩肠道的作用. 硝苯地平为经典的钙离子通道阻滞药，选择性作用于血管及肠道的平滑肌组织，促使血管扩张、血压下降以及肠道的舒张. 由此推论，CVBD 促进大鼠在体肠道收缩的机制可能与增加平滑肌细胞内Ca2+浓度有关. Ca2+在胃肠平滑肌收缩机制中起重要作用，可以启动平滑肌细胞收缩蛋白之间的相互作用3. 本
14、实验通过平滑肌细胞形态学及免疫组织化学染色鉴定，成功分离出原代的大鼠回肠平滑肌细胞，形态分化良好，并观察到每分钟 18 次的自发性收缩，可用于研究细胞表观变化和影响细胞收缩的因素. 研究发现，在Ca2+o 为 1.5 mmol/L 的情况下，CVBD 可以升高平滑肌细胞Ca2+i；若依次预先给予维拉帕米、阿托品，只有维拉帕米可以抑制 CVBD 诱导的Ca2+i 升高. 可见 CVBD 主要通过激活电压依赖性 Ca2+通道（voltagedependent calcium channel，VDCC）引发外钙内流，而与胆碱能 M 受体无关. 在Ca2+o 为 0 mmol/L 的情况下，CVBD
15、同样可以增加平滑肌细胞Ca2+i，而此时没有细胞外 Ca2+内流的参与，表明 CVBD 可以促进平滑肌细胞内钙释放. 平滑肌细胞内游离 Ca2+主要贮存于肌浆网中，有 IP3 敏感和 IP3 不敏感两类钙池，分别由 IP3 受体系统和 RyR 系统调控. 其中普鲁卡因为 RyR 的拮抗剂，肝素则为 IP3 受体的特异性拮抗剂，由于普鲁卡因能够阻断 CVBD 促进平滑肌细胞内钙释放的作用，而肝素则无此作用，可以推断在细胞外钙为零时，CVBD 主要通过 RyR 促使Ca2+i 升高. RyR 是肌浆网膜上的一种细胞内钙释放通道，主要存在于平滑肌、骨骼肌、心肌、非洲蟾蜍母细胞、神经细胞等4. 当电压
16、控制性钙通道开放，少量钙内流，Ca2+与 RyR 上的 Ca2+结合位点结合，而触发肌浆网释放 Ca2+，这种 Ca2+诱发 Ca2+释放(calcium induced calcium release，CICR)的正反馈机制是 RyR 系统触发 Ca2+释放的特征5. 相反，细胞内贮存 Ca2+减少亦可引发细胞外 Ca2+进入细胞（calcium releaseactivated current，CRAC） ，CRAC 多通过非选择性离子通道，且不被 L 型钙离子通道拮抗剂拮抗6. 细胞内钙的释放形成钙波和钙振荡，组成复杂的钙信号时空形式，调节平滑肌细胞的节律性收缩7. 在消化道平滑肌收缩过
17、程中， Ca2+i 增加的两种动员途径存在器官和种属的特异性，并与引起收缩的激动剂有关8. 而大鼠回肠平滑肌受 CVBD 刺激后， Ca2+i 增加来源于两个途径，即细胞外 Ca2+经电压依赖性钙离子通道内流及肌质网雷诺定敏感的贮存 Ca2+释放. 故CVBD 可促进肠道的运动，对于治疗腹胀气具有较大的研究价值. 但CVBD 对肠道平滑肌各型钙通道和钾通道活性的影响还有待于使用膜片箝技术进一步研究. 【参考文献】 1 张惠勤, 黄崇基. 小叶黄杨药理研究初探J. 华夏医学, 2005, 18(3): 334-335. 2 Pacaud P, Feolde E, Frelin C. Charac
18、terization of the P2Ypurinoceptor involved in the ATPinduced rise in cytosolic Ca2+ concentration in rat ileal myocytesJ. Br J Pharmacol, 1996, 118(8): 2213-2219. 3 戴芸,刘新光. 钙离子在胃肠平滑肌收缩机制中的作用J.国外医学消化系统疾病分册, 2002, 22(1): 17-20. 4 Marks AR. Ryanodine receptors/ calcium release channels in heart failure
19、 and sudden cardiac deathJ. J Mol Cell Cardiol, 2001, 33(4): 615-624. 5 Hu XF, Zhu PH, Hu J. Oligomeric interaction between ryanodine receptors: Potential role in Ca2+ releaseJ. Acta Physiol Sin, 2006, 58(4):305-308. 6 Csutora P, Zarayskiy V, Peter K. Activation mechanism for CRAC current and storeo
20、perated Ca2+ entry: Calcium influx factor and Ca2+independent phospholipase A2betamediated pathwayJ. J Biol Chem, 2006, 281(46):34926-34935. 7 李和旺,王宪,韩启德.细胞内贮存钙释放的机制J.生理科学进展,1995, 26(3):209-212. 8 Dai Y, Liu JX, Li JX. Effect of pinaverium bromide on stressinduced colonic smooth muscle contractility disorder in ratsJ. World J Gastroenterol, 2003, 9(3): 557-561.
