1、黄芪药材中黄芪甲苷含量的荧光分光光度法测定【摘要】 目的建立荧光分析法测定黄芪药材中黄芪甲苷的含量方法。方法利用大茴香酸在硫酸介质中与黄芪甲苷反应产生强烈荧光的特性进行测定黄芪中黄芪甲苷含量。结果最大激发波长 Ex 为 320 nm，最大发射波长 Em 为 387nm。测定样品的平均回收率为97.22%，RSD=2.31%（n=5） 。结论该方法灵敏度高，选择性好，结果无干扰，可广泛应用于黄芪药材的质量控制。 【关键词】 荧光分光光度法； 黄芪； 黄芪甲苷Determination of Astragaloside IV in Radix Astragali by Spectrophotofl
2、uorimetryYANG Lianmei ，HU Rong，LIU Yangqing ，LI Guilan, ZHAO Huihui（Yangzhou University,Yangzhou 225001,China；Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024,China；Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100029，China）Abstract：ObjectiveTo determine the content of Arag
3、aloside IV in Radix Astragali by spectrophotofluorimetry.MethodsThe fluorescence characteristics of astragaloside anisic reaction product were used to dertermine aragaloside IV by spectrophotofluorimetr. ResultsThe reaction product of astrogaloside and anisic acid had excitation and emission maxima
4、at 320and 387nm ，respectively.The recovery of measurement was 97.22%（RSD =2.31，n=5）.ConclusionThe method has advantages of high sensitivity, low detection limit and no interference. It also can be used for quality control of Aragaloside IV in Radix Astragali .Key words： Spetrophotofluorimetry； Astra
5、galus membranaceus（Fisch）Bge； Astragaloside IV 黄芪为豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus（Fisch ）Bgevarmongholicu（Bge.）Hsiao 或膜荚黄芪Amembranaceus（Fisch ）Bge 的干燥根，具有补气固表、利尿脱毒，排脓，敛疮生肌等功效1 。黄芪为常用中药，在中药制剂中以黄芪为君药的产品非常多，因此如何控制黄芪的质量至关重要。黄芪甲苷是黄芪主要有效成分之一，也是黄芪皂苷中具有代表性的单体，在抗衰老、调节免疫功能、保护心肌和大脑缺血等多方面具有显著作用2 。黄芪甲苷仅在 200 nm
6、 处有末端吸收，对 HPLC 色谱法紫外检测器检测不利，噪音对结果影响较大，灵敏度也较低3 。2005 年版中国药典采用蒸发光散射检测器测定，具有分离度好，应用范围宽，流动相无干扰等优点，但操作繁琐，价格昂贵，不利于制药公司及基层医疗单位普及。本文根据浓硫酸条件下黄芪甲苷与大茴香酸反应产物具有荧光的特性，采用荧光分光光度法测定不同产地、不同生长年限黄芪药材中黄芪甲苷的含量4 ，以期为黄芪的质量控制提供客观的定量评价依据。1 仪器与试药Perkin Elmer instruments LS45 Luminesence Spectrometer（美国 PerkinElmer 公司 LS45 型荧光
7、分光光度计） ，HX-200A 型高速中药粉碎机，万分之一电子天平 FA/JA 1004 型。72%的硫酸溶液，2%大茴香酸的无水乙醇溶液，石油醚、氯仿、正丁醇（三者均为天津市东丽区天大化学试剂厂产品） ，甲醇（天津市科密欧化学试剂开发中心产品） ，无水乙醇（天津市耀华化学试剂有限责任公司产品） ，以上试剂均为分析纯。黄芪甲苷对照品购于中国药品生物制品检定所（批号 110781-200613） 。黄芪药材采集或购于山西，内蒙两省，经山西中医学院中药鉴定教研室牛燕珍副教授鉴定为蒙古黄芪。2 方法和结果2.1 对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品 5 mg 置 5 ml 量瓶中，加甲醇溶解至刻度
8、，摇匀，即得。2.2 供试品溶液的制备黄芪药材用高速中药粉碎机粉碎（细粉过60 目筛） ，精密称定 0.2g，水煎煮 3 次（40，30，20 min）共 1.5 h，合并水煎液。分别用石油醚，氯仿，正丁醇萃取 4 次，每次萃取剂用量为水煎液体积的 50%，合并正丁醇相，总体积为 30 ml，正丁醇相挥干，用甲醇溶解备用。测定时，移取供试品溶液 1 ml 置 10 ml 容量瓶中，加入2%大茴香酸溶液 0.6 ml，72%硫酸溶液 0.8 ml，60水浴中反应 20 min，迅速冷却后用无水乙醇定容至刻度，摇匀，在荧光分光光度计下测定荧光强度，黄芪甲苷反应产物最大激发波长 Ex=320 nm，
9、最大发射波长Em=387 nm，同时测定无黄芪甲苷对照品的试剂空白的荧光强度。2.3 线性关系的考察精密量取对照品溶液（1.0 mgml-1）10，25，50，75，80 l，照“2.2”项下制备方法操作，以对照品溶液浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，得回归方程为 Y=91.465X+5.702 4，r=0.999 7，结果表明黄芪甲苷在 1.08.0 gml-1，其浓度与荧光强度呈良好的线性关系。2.4 精密度实验精密量取同一供试品溶液，照“2.2”项下制备方法操作，连续 6 次测定其荧光强度，RSD 为 0.10%，表明仪器精密度良好。2.5 稳定性实验取同一对照品溶液，照“2.2”项下制
10、备方法操作，分别在 0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 ，6.0 h 检测，测得黄芪甲苷荧光强度分别为308.2，308.5，303.3，304.7，304.1，302.9，289.1，RSD 为 2.15%，结果表明对照品溶液在室温下放置 6h 内稳定性良好。2.6 重复性实验取同一批药材，精密称取平行样品 6 份，每份0.2 g，照“2.2”项下制备方法操作，连续 6 次平行测定，RSD 为1.41%，表明方法重复性良好。2.7 回收率实验采取加样回收法，精密称取 5 份已知含量的同一批样品 0.2 g，精密加入黄芪甲苷对照品溶液 20l（1.0 mgml-1） ，照“2.2”
11、项下处理并测定。结果见表 1。表 1 回收率实验结果（略）2.8 样品的含量测定取不同产地的黄芪药粉各 0.2 g，精密称定，照“2.2”项下处理并测定。测定结果见表 2。表 2 不同产地不同生长年限黄芪药材中黄芪甲苷含量比较（略）由表 2 可以看出，不同产地的黄芪药材生长年限对药材中黄芪甲苷含量的影响是不同的,生长年限对黄芪药材中黄芪甲苷含量的影响很有限，而产地对其影响则是主要的。由此说明，道地药材对于中药的质量多么重要。从总体看，山西应县和内蒙古固阳县下湿壕乡的黄芪药材中黄芪甲苷含量最高；2 年生的黄芪药材中黄芪甲苷含量最高，5 年生的最少。所以黄芪药材以 2 年生为宜，不用栽培 5 年再
12、采集药用。3 讨论笔者对黄芪甲苷的提取方法和溶剂进行了考察。比较煎煮法，回流法，超声法提取 3 种方法，结果表明煎煮法提取含量最高，黄芪甲苷的荧光强度最强。同一提取方法，不同提取溶剂对黄芪甲苷的荧光强度有影响，颜色变化显著。采用超声法，分别用水，甲醇，正丁醇做提取溶剂，提取完毕后测定荧光强度，结果表明，水做提取溶剂时荧光强度最高，甲醇次之，正丁醇的荧光强度最低。由此可见，同一物质在不同溶剂中其荧光光谱的形状和强度都有差别，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移，荧光强度也增强。黄芪中的主要化学成分包括皂苷类，黄酮类及多糖类等，由于黄芪所含成分复杂，对样品纯化要求很高，用正丁醇提取液经 5%碳酸氢钠洗
13、涤，可除去大量含酚羟基的成分如黄酮和其他酚性干扰物质。有研究表明，采用 KOH 碱化，正丁醇提取，再用 Na2HPO4 溶液提取去杂质，也可使测定结果符合分析要求。 中国药典2005 版中黄芪药材的制备方法较繁琐且加入了氨试液，使黄芪甲苷的总量明显增加。分析原因，用氨试液处理样品的主要作用是将黄芪醇类皂苷酯氨解为黄芪甲苷，从而明显增加药材中黄芪甲苷含量5 。此外，加同量的氨试液，不同的静置时间，黄芪甲苷的转化量也有差别。有研究表明，用氨试液处理，当pH11，静置时间为 30 min 时，药材中黄芪甲苷的含量最高6 。由此可见，碱液类别不同，所起的作用也有差别，有待进一步研究。考虑到上述原因，本
14、实验中未加入氨试液洗涤，测定的是黄芪药材中原有的黄芪甲苷含量，不包括任何转化的黄芪甲苷含量。【参考文献】1国家药典委员会.中国药典，部S. 北京：化学工业出版社，2005：212.2林 琦，陆 阳，陈 泽. 黄芪属植物皂苷类成分研究进展J.国外医药植物药分册，2002，17：143.3钱广生，刘三康，李章万. HPLC 测定黄芪注射液中黄芪甲苷的含量J 华西药学杂志，2002，17（1）：41.4刘养清，杜 鸣，徐秉久.大茴香酸-硫酸荧光体系测定黄芪甲苷J 药学学报，2000，35（7）：544.5田南卉，杨国红，方 颖，等 高效液相色谱法蒸发光散射检测器测定黄芪和制剂中黄芪甲苷的含量J药物分析杂志，2000，20（3）：199.6姜 勇，金 芳，鲍 忠，等.不同来源黄芪药材中黄芪甲苷的定量分析J 中国中药杂志，2006，31（11）：930.
