1、基因枪介导的 pSilencercJun 载体对大鼠结肠组织的 RNA 干扰效应作者：库热西玉努斯，韩明国，郭霞，龙梅，贺捷，袁武梅，哈木拉提吾甫尔 【关键词】 RNA 干扰，基因枪，cJun ，基因治疗 0 引言 RNAi 要进入实际应用，迫切需要解决的问题是如何研制有效的给药系统将 siRNA 分子准确传送到靶组织. 基因枪技术已经在肿瘤基因疫苗研制方面得到了应用，并且成功地介导特异 siRNA 抑制肿瘤细胞生长1. 从而为联合应用 RNAi 干扰和基因枪技术对以 cjun 为靶点的基因治疗的实现提供了实验依据. 前期研究中 pSilencercjun 载体在COS7 细胞中显示良好的基因
2、沉默效率，我们将基因枪技术与 RNAi 技术结合起来，直接运用基因枪轰击大鼠结肠组织，将 RNAi 实验运用于活体组织，验证基因枪介导的活体动物基因沉默. 1 材料和方法 1.1 材料 体质量 200250 g SPF 级 Wistar 大鼠 8 只.质粒提取试剂购自上海生工，pSilencer 载体购自 Ambion, cJun, actin 抗体购自 Santa cruz 公司，二抗购自北京中杉金桥生物公司. 1.2 方法 1.2.1 基因枪及子弹制备 SJ500 手提基因枪购自宁波新芝公司，金粉由宁波新芝公司馈赠，子弹制备按亚精胺CaCl2 包被法. 1.2.2 动物实验 大鼠手术开腹，
3、选择其自肛门 58 cm 段结肠，按操作说明书用基因枪轰击大鼠 cjun 基因特异性 pSilencer 质粒，缝合关腹.轰击 24 h 后脱颈椎处死，剪取相应结肠组织. 1.2.3 Western Blot 检测 大鼠结肠组织 cJun 蛋白的表达取大鼠的结肠组织 0.5 g，剪碎加入细胞裂解液，匀浆裂解 40 min ，12000 g/min 离心 5 min，收集上清液进行蛋白定量（考马斯亮蓝法）. 变性 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移，丽春红 S 染色，封闭非特异性的结合位点，TBST 洗膜，然后加入抗 cJun 的 mAb（1200）孵育 2 h. TBST 洗膜后加入结合有辣根
4、过氧化物酶标记的鼠抗兔的 IgG 二抗（14000）孵育 2 h. 化学发光、显影、定影，actin 蛋白作为内参照. 2 结果 Western Blot 显示内参照 actin 蛋白表达没有差异，pSilencercjun 载体干预时 cJun 蛋白表达明显减少，载体剂量为9 g 以上时基本完全被抑制. 3 讨论 cJun 蛋白可与原癌基因 Fos 家族的产物 Fos 蛋白形成异源二聚体激活蛋白1(AP1). 且与其结合位点（佛波酯反应元件，TRE）特异序列高效率结合，诱导基因转录，导致炎症、肿瘤等多种疾病的发生. 由于 cFos 不具有 DNA 结合能力，只有与 cJun 结合后才能形成A
5、P1 2. RNA 干扰现象自发现以来，已经应用脂质体、逆转录病毒、电穿孔等一些化学和物理的方法，将 RNAi 的效应分子 siRNA 转染入真核细胞中发挥作用3. 但是，是否能将稳定性差、组织靶向性低的siRNA 分子正确导入生物活体内，一直是临床运用的最大问题. 基因枪技术可以将附着在大量金属微粒上的质粒，组成“基因子弹”后，在高压气体的驱动下打入组织进入细胞后发挥相应作用. 此技术具有迅速方便, 安全性高、对靶细胞要求低，基因用量少，无限制转移基因长度的特点. 本研究运用基因枪技术将特异性的 pSilencerTM1.0U6cJun 导入活体大鼠结肠组织抑制了 cJun 的表达. 结果显示当 psilencer 载体剂量 9 g 以上时 cjun 的表达基本完全被抑制在(图 1). 证明外源质粒可以诱导活体组织的 RNA 干扰,为致病基因和药物靶基因的筛选创造良好的条件，并为今后运用 RNA 干扰技术治疗炎症、肿瘤等结肠疾病奠定了基础.
