1、免疫亲和纯化和免疫沉淀技术,泸州医学院免疫学教研室 刘佳佳20010年4月,亲和层析及沉淀的用途,亲和层析及沉淀被认为是分离纯化酶及蛋白质的强有力的技术手段，这种方法可以较经济有效地使用配基，能够大规模、快速、特异性地分离、纯化酶及蛋白质。,蛋白质的功能,蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能。,蛋白质分离纯化,蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之中分离纯化出所需要得到的目的蛋白质的方法。蛋白质分离纯化技术是当代生物产业和生命科学研究当中的核心技术。该技术难度和成本均高；例如
2、一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。,生物工程上游技术:是理论的研究, 技术的开发等, 如：基因工程、蛋白质结构和功能研究等。 生物工程下游技术：一般包括产物（一般为蛋白质）的预处理及分离纯化；产品的成型加工和质量监控等一系列单元操作和过程中的主要技术,其中生化产物及发酵产物的分离纯化是其核心内容。下游技术是生物工程重要组成部分,是生物高科技技术实现产业化的关键，如：酶工程 , 发酵工程等（提取干扰素、胰岛素和酶等）。,蛋白质分离纯化的意义,从生物材料中分离制备蛋白质，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制
3、革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。 医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。 基因工程的需要：DNA合成酶、RNA逆转录酶等。,蛋白纯化策略,分离蛋白质常用的纯化方法有超速离心和梯度密度离心法、盐析法、电泳、凝胶过滤（分子筛）、离子交换层析、亲和层析以及高效液相色谱等方法 。亲和沉析技术是纯化各种生物大分子最有效的方法之一。,超速离心 是分离亚细胞及蛋白质大分子的有效手段，往往是进一步纯化的第一次过筛。超速离心又分差速离心和梯度离心。用超速离心或梯度离心分离和纯化抗原只是一种根据蛋白的比重特点分离的方法，除个别成分外，极难将某一抗原成分分离出来。目前
4、仅用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲状腺球蛋白等，以及一些比重较轻的抗原蛋白如载脂蛋白A、B等。对于大量的中、小分子量蛋白质，多不适宜用超速及梯度密度离心作为纯化手段。,盐析沉淀法 是最古老而又经典的蛋白质纯化分离技术。由于方法简便、有效、不损害蛋白抗原活性等优点，至今仍被广泛应用。,盐析法原理,盐析沉淀法的原理 因为蛋白质是亲水性大分子，所以在水溶液中有双电层结构的水合膜，来保证分子的溶解度平衡并稳定存在。 当加入盐时，盐会电离成离子态，离子的电性破坏了蛋白质的双电层的水合膜结构，从而使其沉降，析出。 加入浓酸和浓碱是不行的，苛性的环境将使蛋白质变性。,凝胶过滤和离子交换层析 凝胶过
5、滤又称凝胶柱层析、分子筛层析，利用微孔凝胶，将不同分子量的成分分离。离子交换层析是利用一些带离子基团的纤维素或凝胶，吸附带相反电荷的蛋白质，将蛋白质按带电荷不同或量的差异分成不同的组分。这两种层析如能共同应用或者反复应用其中的一种，皆可将某一蛋白质从一复杂的组分中纯化出来。,凝胶过滤(分子筛层析)图示1,凝胶过滤(分子筛层析)图示2,离子交换层析柱,亲和层析 是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。 例如抗原和抗体（免疫亲和层析）、 酶和酶抑制剂（或配体）、酶蛋白和辅酶、激素和受体等之间有一种特殊的亲和力，在一定条件下，它们能紧密地结合成复合物。如果将
6、复合物的一方固定在不溶性载体或共价结合在一种惰性的微珠上，则可从溶液中专一地分离和提纯另一方。与上述其他纯化方法相比，亲和层析能产生相当高的纯化作用。另外，此法的优点是迅速，有时仅一步即可达到纯化的目的。,免疫亲和纯化技术,亲和纯化(affinity purification)是基于目标分子与固定化配体的特异性相互作用(如：抗原-抗体)。亲和技术可用来从混和物中分离特定分子。捕获目标分子用于相互作用研究, 或从反应体系中去除某一成分。,免疫亲和纯化原理,免疫亲和纯化是一种分离各种生物大分子最有效的方法特点：1、高纯化率，通常为常规纯化的1,000-10,000倍以上。2、由于内在的背景限制，如
7、目标抗原量非常稀少，需与其他方法结 合才能获得均质性产物。3、快速纯化抗原，层析柱常可重复使用。可按照不同规模进行，半 天内即可完成。4、不仅适用于纯化抗原，也可用来分离经过初步纯化的抗体，乃至 所有能与相应配体有效结合的生物分子。5、抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性，能大量分离天 然状态或近似天然状态的抗原。6、需要适当纯化的抗体，不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析， 但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就简单、快速、可靠 。 7、不能用于定量测定。,免疫亲和纯化技术发展历史：最早是将抗体作为一种结合剂用于免疫亲和纯化，根据其自身交联产生大量多聚体和不溶性基质原理收集抗原。随后利
8、用抗体与惰性微珠共价结合，虽然这是一种简单的结合，但抗体的许多反应性因缺乏定位作用或抗体的过量结合而丧失。通过研究发现，抗体与蛋白A和蛋白G微珠共价连接后更容易与抗原结合。将具有良好抗原结合特性且来源广泛的各种单克隆抗体制成免疫亲和层析柱，已成为一种最适用和有效的纯化方法。亲和层析技术最先是由Cuatrecasas等人建立（1968年）。 BCX2003P2.PPT,影响免疫亲和层析纯化效果的因素抗原初始相对浓度（即纯度）：是决定最终产物纯度极为重要的因素。抗原与抗体的亲和力：是免疫亲和纯化层析过程中最麻烦的问题。高亲和力抗体（10-8 mol/L)能在1 h以内达到有效的分离，而低亲和力的抗
9、体(10-6 mol/L）即使在高浓度时也不能结合溶液中的全部抗原。使用针对同一抗原多个表位的多克隆抗体以增强亲和力的方法固然可结合较多的抗原，但增加了洗脱的困难性。只有当所需的最终产物为变性蛋白时，才选用识别多个表位的抗体。,免疫亲和纯化的关键：高亲和力与容易洗脱的优化组合。常见错误是将低亲和力和容易洗脱等同看待。,1亲和层析支持物的选择:作为亲和层析支持物须符合以下要求：非特异性吸附低；液体通过时流速要快；在各种pH和高浓度盐溶液中稳定；必须有合适的、丰富的化学基团，能有效地与蛋白质或其它化合物结合；必须带有丰富的微孔，以增加结合容量。符合以上5个条件的支持物有琼脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃
10、球，其中常用的是琼脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）。,2配体的选择:所谓配体系指具有亲和性的双方，作为免疫亲和层析专指抗原与抗体。良好的配体必须具备以下3个条件。（1）抗原或抗体必须单一特异性：抗原或抗体的纯化效果决定于固相中配体的纯度。（2）抗原与抗体之间必须有强的亲和力：这种亲和力决定于抗原决定簇的性质和数量。对抗体来说还决定于抗体来源动物的种类和免疫时间，如马抗血清亲和力较低，免疫血清亲和力较高；免疫时间短的亲和力低。但是，亲和力太强也不利，因为解离抗原抗体复合物所需要的条件就要强烈，从而可造成蛋白质的变性。例如用低pH（1.52.5）或高盐（如6 mol/L盐酸胍）可使部分
11、抗原或抗体活性降低或丧失。（3）配体必须有一个适当的化学基团：这个基团不参与配体和大分子的特异结合，但可用来连接支持物，而且这种连接不应当影响配体与大分子结合的亲和性。,3抗原或抗体与支持物的结合将抗原或抗体结合到支持物上的方法目前有20多种，但可归结为载体结合法、物理吸附法、交联法和网络法4类。,结合法的一般步骤是先活化支持物上的功能基团，然后将抗原或抗体连接到这些活化的基团上。用来发生交联的化学反应必须足够温和，不致使抗原或抗体遭到破坏。交联后，要彻底清洗支持物，以除去剩下的未交联的物质。,最常用的支持物是Separose 4B，将此支持物与溴化氰在pH11时进行处理，则能使支持物活化。此
12、时溴化氰与支持物上的羟式反应形成氨基甲酸酯基团。加入溴化氰的量取决于支持物的量。如果希望取代程度提高，则加入溴化氰的量也要提高。交联时首先要注意加入抗原或抗体的浓度。通常在交联反应混合物中的交联蛋白质浓度应是亲和分离浓度的2030倍。这样，溴化氰浓度也必须提高到 200 mg/ml凝胶。若希望最终产物含量较少，所加入的溴化氰也应减少。交联时的pH也应注意，pH9.510时，活化的琼脂糖珠很不稳定。降低pH，也就减少了能反应的配体浓度，交联量就会减少。,亲和层析中常用小分子抗原或其它化合物与支持物交联，由于载体空间的位阻而影响了与抗原或其它亲和物的结合，产生了所谓的无效吸附。另外，Sepharo
13、se 4B交联时要求有一游离的氨基，如果该抗原有具氨基则难于交联。基于这两个原因，通常在琼脂糖与抗原之间接上不同长度的“手臂”。必要时这些“手臂”末端可接上游离氨基，以与不带氨基的配基偶联。常用的带“手臂”琼脂糖有氨基琼脂糖（二亚胺）、羧基琼脂糖（琥珀酸酐）、溴乙酰琼脂糖（0-溴乙酰-N羧基琥珀酰胺）、重氮盐衍生物琼脂糖和疏基琼脂糖等。这些带“手臂”的琼脂糖有商品供应，使用极为方便。,注：不推荐将未经纯化的多克隆抗体或混合的单克隆抗体用于免疫亲和纯化。,免疫亲和纯化层析的基本操作步骤：交联结合洗脱1、将抗体与基质（微珠）共价交联并制备抗体亲和层析柱。2、将抗原结合到抗体-基质微珠上。3、抗原的
14、洗脱。,亲和层析条件的选择：（1）支持物与抗原或抗体结合后，还可能有多余的活性基团， 为了封闭这些残基团，必须用无关蛋白质或三乙醇胺过一次柱，以封闭活性基团。（2）去掉未结合及结合不牢固的蛋白质。 先用0.2 mol/L NaHCO2（含0.1 mol/L NaC1，pH 9.0）洗脱23个柱体积，再用解脱剂处理一次亲和层析柱。（3）解脱剂有多种：常用的有0.2 mol/L pH 2.8 甘氨酸HC1缓冲液、0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液、7 mol/L脲、5 mol/L NaI、3 mol/L硫氰酸钾（或钠）、1 mol/L乙酸、6 mol/L盐酸胍、0.2 mol/L KC1等。
15、作为抗原抗体解脱剂，最多用的是3 mol/L硫氰酸钾（或钠）及0.1 mol/L pH 2.4甘氨酸缓冲液。,抗体亲和层析柱的制备：抗体与固相基质的连接：1、最常用的基质为蛋白A和蛋白G微珠， 可与抗体的Fc功能区特异结合。2、将抗体直接与一种活性微珠（表达活 性的反应基团）连接。,抗体与微珠的结合方法,从免疫亲和层析柱上洗脱抗原：理想的洗脱峰形为一清晰的尖峰，用单一的缓冲液处理后可使抗原完全释放。探索最佳的洗脱条件是一项积累经验的工作。有三种方法： 1、用较强烈的条件处理; 2、加入模拟结合位点的饱和量小分子化合物; 3、使用一种能引起构象改变而使抗原释出的 试剂。,洗涤液和洗脱液的选择,免
16、疫沉淀技术是利用抗体与相应抗原的高亲和力特性作为检出和结合溶液中靶分子的方法，通过将抗原聚集在惰性微珠上，可以简单快速的将抗原纯化1000-10000倍。,免疫沉淀 (Immunoprecipitation),免疫沉淀的应用： 1、目标抗原的纯化。 2、确定蛋白质相对分子质量。 3、测定蛋白质抗原半寿期。 4、蛋白质翻译后修饰的测定。 5、研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。 6、蛋白质内在或相关酶活性的测定。 7、裂解物特定抗原的清除。,免疫沉淀的特点：1、确定抗原的存在、质量、大小、转换、修饰及相关性；2、多个步骤共需1/2-1天；3、半定量到定量；4、敏感性取决于抗原的相对质量及抗体的亲和
17、力；5、需要高亲和力的抗体。,免疫沉淀的主要影响因素：1、抗原原液的丰度2、抗体对抗原的亲和力,合适抗体的选择,免疫沉淀步骤：一、抗原溶液的制备二、裂解物非特异性本底的预处理三、免疫复合物的形成与纯化 http:/www.bio.davidson.edu/courses/genomics/IMPfolder/IMPQ.html,一、抗原溶液的制备1、裂解细胞： 细胞裂解过程中有多种蛋白酶释放，会导致蛋白质的降解从而影响免疫沉淀，解决方法有两种：低温操作或加入蛋白酶抑制剂。,2、裂解液的选择：裂解条件应尽量温和，以保护抗体结合位点及避免蛋白的溶解，但裂解条件又应足够剧烈，以保证抗原的定量释放。对
18、于去污剂的使用，非离子型优于离子型，低浓度优于高浓度，单离子优于混合型。免疫沉淀最常用的去污剂是NP40和RIPA，它们能释放大部分可溶性的胞浆蛋白和核蛋白，而且不损伤染色体DNA。最好不要释放DNA，因其影响溶液的粘着性。,3、裂解原则：在释放尽可能多抗原、引起尽可能少蛋白变性的前提下，将可溶性抗原从基质颗粒中分离出来，并且要避免和消除大分子DNA进入溶液。,4、裂解方法：组织培养细胞的裂解：最普遍的问题是抗原不能完全从细胞中释放。一般不推荐冻融法，因反复冻融会使蛋白质过量降解，原因不明。机械性剪切（使用超声波发生器、Dounce匀浆器、波特器和搅拌器等）特别适用于大体积制备或需避免使用去污
19、剂时。最有效的方法是用去污剂处理。,细菌的裂解：最常用的方法是将细胞进行短促和高频率的超声处理，可以破坏几乎所有的细菌细胞壁，并能剪切DNA微小分子，不影响样品的粘稠性，容易操作，样品质量好，费用低。最常见的问题是裂解时蛋白质抗原可能发生变性。,酵母细胞的裂解：最好方法是将玻璃微珠和酵母细胞一起涡旋震荡进行机械破碎。此法充分利用玻璃微珠的快速转动撞击酵母菌从而机械破碎裂解酵母细胞，是一种强有力的裂解方法。最常见的问题是蛋白质抗原的变性。,变性裂解：对不同来源的抗原，一个有效的裂解方法是用强烈的变性溶液处理细胞，以释出大部分蛋白质抗原。然后将裂解物经过稀释或透析降低变性条件，使其适于形成抗原抗体复合物。最主要的问题是许多抗体不能识别完全变性的蛋白质抗原。,5、裂解物的预处理：将裂解物通过一系列模拟免疫沉淀的步骤，将不能识别靶抗原的抗体加入裂解物内，如同正常免疫沉淀进行操作，去除所有可能污染免疫沉淀最后步骤的非特异蛋白。优点主要是降低非特异本底，缺点是费时。如最后检测是免疫印迹则无需此步。,6、免疫复合物的纯化：影响因素： (1)抗体的用量； (2)免疫沉淀的体积； (3)蛋白A与蛋白G的选择。,多克隆抗体 单克隆抗体,蛋白A与蛋白G的比较,谢谢大家！ Thank you very much.,
