1、流式细胞仪在临床检测和临床科研中的应用,李 柏 青蚌埠医学院免疫学教研室,-2-,流式细胞仪和流式细胞术概述流式细胞仪的工作原理和测量参数流式细胞仪在临床检测和科研中的应用免疫学检测和科研应用血液病检测和科研应用肿瘤学检测和科研应用,流式细胞仪的基本工作原理以及在基础和临床科研中的应用,-3-,一、流式细胞仪和流式细胞术的基本概念,流式细胞仪(Flow Cytometer， FCM):是集合光电子物理，光电测量技术， 液流技术，计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。,-4-,一、流式细胞仪和流式细胞术的基本概念,流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):是应用流式细胞
2、仪，对处于快速流动液体中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速测量和定量分析，以及分选的技术。,-5-,一、流式细胞仪和流式细胞术特点,多参数测量和分析（散射光和荧光） ；快速测量和分析每秒可达1000-10000个细胞分选纯度可达99%以上。获取的数据分析结果更具有统计学意义；通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液中。此外，也可测量微生物等生物颗粒，或者工合成微球非生物颗粒，,-6-,台式机FACSCalibur,双激光 488nm 635nm四荧光参数分选、浓缩系统,7,-8-,大型机FACSVantage SE,科研型八荧光参数高速分选多路分选,-9-,流式细胞仪与荧光显微镜比较,流
3、式细胞仪 荧光显微镜,流动的细胞 静止的细胞样本 数量大 数量少 高速分选 样本难以再利用 细胞群体特征量分布 可揭示细胞内部结构信息,-10-,二、流式细胞仪的工作原理和测量参数,光路系统： 激光光源，光路系统（透镜、滤光片）电子系统：光电倍增管（PMT），补偿电路液流系统： 鞘液系统，样品流动系统数据系统：计算机，数据测量和分析软件。细胞分选系统,（一） 流式细胞仪的结构,-11-,流式细胞仪光路系统,激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照激光波长: 488nm, 635nm光收集系统是由若干组透镜, 滤波片, 小孔组成，将产生的光信号引导至检测器,
4、-12-,光路系统,-13-,Injector Tip,-14-,Injector Tip,Fluorescence,signals,Focused laser,beam,Sheath fluid,-15-,流式细胞仪光学系统,激发光源与荧光标记物,-16-,光学检测信号,-17-,流式细胞仪的光学系统 FACSCalibur,-18-,流式细胞仪液流系统,-19-,液流系统：鞘液系统样品流动系统,-20-,流式细胞仪的电子系统,信号检测和分析当细胞携带荧光素, 通过激光照射区, 受到激发产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号荧光信号由光电接收器接收，转变为电脉冲信号，电脉冲信号经A/D
5、转换成数字信号数字信号传送到计算机，进行储存、作图和统计分析,-21-,数据系统,-22-,（二） 流式细胞仪可检测的细胞参数,细胞结构细胞大小细胞颗粒性程度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量,细胞功能细胞表面蛋白抗原细胞胞浆内蛋白性抗原细胞内细胞因子细胞增殖细胞内钙离子浓度,二、流式细胞仪的工作原理和测量参数,-23-,（二） 流式细胞仪可检测的细胞的参数： 散射光信号,前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 入射光的前向 (5)散射光信号, 可反映：细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC, Side Scatter） 入射光90角的散射光信号， 可反
6、映：细胞颗粒性程度 （胞内成分和构造和表面结构的复杂性）,-24-,散射光信号,前向角散射光FSC,-25-,散射光信号,侧向角散射光SSC,-26-,流式细胞的基本信息: “形态”,-27-,-28-,外周全血细胞（红细胞溶解后） 以散射光表示的 双参数 点图,-29-,外周全血细胞（红细胞溶解后） 以散射光表示的 双参数 点图,中性粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,-30-,（二） 流式细胞检测细胞参数: 特征信息荧光（Fluorescence）信号,荧光素吸收激光（激发光波长）能量荧光素将吸收能量释放，转换为释放较入射光波长更长的光量子（发射光波长）荧光素与特异抗体结合（荧光抗体）荧光抗体与细
7、胞抗原结合越多，产生荧光信号越强荧光素与细胞核酸结合，荧光强度反映核酸含量,-31-,（二） 流式细胞检测细胞参数: 特征信息荧光（Fluorescence）信号,Forward scatter (FSC)Side scatter (SSC)FL1 （第一荧光） -FITC(异硫氰酸荧光素）FL2 （第二荧光） -PE（藻红蛋白）FL3 （第三荧光） -PerCP, PeCy5等PL4 （第四荧光） -APC（藻青蛋白）,-32-,荧光信号,-33-,-34-,荧光信号,双色直接染色,-35-,（三） 流式细胞仪分析数据常见图形：（二维）点陈图 (Dot Plot),适用于：双参数分析,-36
8、-,（三） 流式细胞仪分析数据常见图形： 直方图(Histogram Plot),适用于：单参数分析仅需要观察某个荧光强度的变化,-37-,流式细胞术检测细胞的荧光 标记方法,单标： 一种单抗 : FL1, FSC, SSC（三参数）双标： 两种单抗：FL1, FL1, FSC, SSC（四参数）三标： 三种单抗：FL1,FL2, FL3,FSC, SSC（五参数）四标四种荧光标记抗体：四种单抗：FL1,FL2,FL3,FL4,FSC,SSC（六参数）,-38-,淋巴细胞亚群分析,细 胞 凋 亡,肿瘤学,移植免疫,三 流式细胞仪在临床检测和科研中的应用,血小板,其 它,,-39-,淋巴细胞亚群
9、分析,,-40-,-41-,-42-,-43-,T淋巴细胞,淋巴细胞亚群检测： T cells, T subsets, NK cells, B cells,-44-,淋巴细胞亚群,,-45-,淋巴细胞亚群,,-46-,淋巴细胞亚群与疾病,,-47-,淋巴细胞亚群检测意义,疾病机理研究,疾病辅助诊断,移植后免疫检测,治疗方案的确定及疗效评价,CD25高于正常值5-10%, 表明即将或已发生排斥CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染 0.2时, 必须停用免疫抑制剂CD2+HLA-DR+增加5-10%, 且不伴有CD25的增加, 提 示巨细胞病毒感染,慢性疲劳, 感染后综合征, 纤维肌痛, 类风湿性
10、关节炎, 过敏等,疾病预防,,-48-,淋巴细胞亚群检测意义,鉴别活动期和非活动期SLE,,-49-,HIV AND AIDS,-50-,Th1/Th2细胞,,-51-,Th1/Th2细胞,Th1型细胞因子介导 细胞免疫反应引起迟发型过敏反应、巨噬细胞活化、局部炎症刺激来源：病毒、某些细菌Th2型介导体液免疫反应引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、促进I型变态反应（过敏反应）刺激来源：多细胞寄生虫、过敏原,-52-,Th1/Th2细胞,PMA+Ionomycin 刺激4-6hr,,-53-,流式细胞仪检测胞内细胞因子,新鲜分离PBMC 加PMAIo刺激后6h测定胞内细胞因子IL-4和IFN-
11、g,检测免疫细胞表型和结合检测胞内细胞因子： 操作和分析方法；,-54-,四色标记胞内因子FCM检测,-55-,Th1/Th2失衡相关疾病,嗜酸性细胞增多和IgE升高相关疾病 Ommens Syndrome(Ommens综合征) Hyperosinophilic Syndrome(高嗜曙红细胞综合征) Kimuras Disease(Kimuras疾病) Wells Syndrome(Wells 综合征)传染病 病毒性疾病 人类免疫缺陷性病毒感染和爱滋病(AIDS) 麻疹 呼吸道合胞体病毒感染 慢性活动性乙型肝炎病毒感染 分枝杆菌和其它细菌感染 麻疯病/肺结核 鸟结核分枝杆菌复合感染 滑膜炎反
12、应性关节炎 淋病和梅毒,,-56-,Th1/Th2失衡相关疾病,寄生虫病 原寄生虫感染：皮肤和内脏利什曼病 蠕虫病：丝虫病和血吸虫病真菌性疾病 过敏性支气管肺霉菌病 念珠菌病 隐球菌病 类球孢子菌病 球孢子菌病 组织胞浆菌病恶性肿瘤 皮肤基底细胞和鳞细胞癌 Sezary Syndrome (Sezary综合征) 淋巴瘤 EBV相关的B细胞和非何杰金氏淋巴瘤 何杰金氏淋巴瘤 大细胞退行性(CD30+)淋巴瘤 多发性骨髓瘤和Castlemans综合征 卡氏肉瘤,,-57-,Th1/Th2失衡相关疾病,变应性疾病 皮肤性哮喘 变应性哮喘 春季结膜炎炎性和自身免疫性疾病 巨细胞(暂时性的)动脉炎 系统
13、性红斑狼疮 类风湿性关节炎 自身免疫性甲状腺疾病 类肉瘤病 银屑病(牛皮癣) IgA肾病 多发性硬化,,-58-,Th1/Th2细胞检测意义,疾病治疗,发病机制研究,使用Th1和Th2相关的细胞因子 IFN-治疗麻疯病,用抗Th1和Th2相关细胞因子或其受体的抗体 抗IL-4抗体治疗真菌和寄生虫感染,使用调节Th2/Th2细胞因子平衡的药物: 萨力多胺(Thaliodomide) 治疗巨细胞动脉炎,疾病治疗监测,,-59-,,-60-,肿瘤发生发展,,-61-,0,200,400,600,800,1000,PI 荧光强度(DNA含量),DNA含量分析,2N,4N,Counts,G0/G1,G2
14、/M,S,,-62-,DNA含量分析,70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变,1. Ross JS. DNA Ploidy and Cell Cycle Analysis in Pathology. New York: Igaku-Shoin;1996:47-60,DNA倍体和S期比例-指导治疗2 卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，原发部位不明的癌症 -早期 (I/II期)DNA倍体和DNA指数-预后长期和无病生存期2 卵巢癌-晚期,2. The Recommend Medicare National Coverage Policy for Flow Cytometry. HCFA W
15、ebsite,1999,,-63-,P53/Bcl-2,,-64-,P53,乳腺癌,与病理学分级有关, 并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关,大肠肿瘤,早期发现大肠癌,胃 癌,与预后相关,肝细胞癌,与组织分级, 肿瘤预后, 转移及肿瘤大小密切相关,,-65-,Bcl-2,Bcl-2在正常组织中的表达,造血系统细胞 淋巴, 单核细胞等 受激素或生长因子调节的腺上皮 前列腺上皮, 子宫内膜等 干细胞或增值细胞 皮肤的基底细胞, 肠上皮 寿命长的分裂细胞 神经元 胚胎组织,Bcl-2在肿瘤组织中的表达,肾脏肿瘤 肾癌, 肾盂乳头瘤, Wilms瘤, 肾嗜酸细胞瘤 前列腺癌 B细胞性淋巴瘤 乳腺癌 (43%
16、) 甲状腺癌,,-66-,nm23,nm23与多种肿瘤的转移及预后相关,肝细胞癌 甲状腺肿瘤 乳腺癌 结肠癌 肉瘤,,-67-,CD44(CD44s/CD44v),,-68-,肿瘤多药耐药性(MDR)检测,P-gp在肿瘤组织中的表达,乳腺癌, 膀胱癌, 胃癌, 食管癌, 卵巢癌, 前列腺癌等,化疗前高表达,化疗后高表达,肾细胞癌, 结肠癌, 肝癌,肾上腺皮质癌, 胰腺癌等,化疗前低表达,非何杰金氏淋巴瘤, 成神经细胞瘤, 急性髓白血病等,化疗不敏感,化疗敏感,化疗不敏感,,-69-,乳腺癌,石蜡切片,脱腊,ER(雌激素受体),ER抗体染色,酶解,流式检测,固定(多聚甲醛),破膜(70%甲醇),
17、细 胞,,-70-,Cyclin(细胞周期蛋白),,-71-,,-72-,细胞凋亡分析,-73-,DNA断裂,,-74-,乳腺癌,Fas/FasL与疾病,慢性病毒性肝炎,恶性肿瘤细胞-黑色素瘤、结肠癌、肺癌、肝癌等,脑缺血后细胞凋亡,自身免疫性疾病系统性红斑狼疮,Fas/FasL(CD95/CD95L),,-75-,乳腺癌,Caspases,早期细胞凋亡,Annexin V/PI,,-76-,移植免疫,,-77-,CD25高于正常值5-10%, 表明即将或已发生排斥CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染 0.2时, 必须停用免疫抑制剂CD2+HLA-DR+增加5-10%, 且不伴有CD25的增
18、加 提示巨细胞病毒感染,移植后免疫监测,,-78-,血小板,,-79-,血小板活化,静止血小板,活化血小板,,-80-,血小板活化,,-81-,网织血小板,ITP(特发性血小板减少症),化疗,鉴别诊断,骨髓移植,,-82-,血小板计数新标准(间接双平台法),R = 红细胞数/血小板数(流式细胞术),血小板数=红细胞数(血球仪)/R,(国际血液学标准化委员会(ICSH)/国际实验血液学协会(ISLH) 2001),,-83-,其 它,,-84-,HLA-B27,,-85-,正常人,患 者,HLA-B27,,-86-,细胞介导的细胞毒作用,,活靶细胞,死靶细胞,替代51Cr释放实验,-87-,HL
19、A-B27检测,Calibration beadsHLA-B27 calibration beadsDecision markerHLAB27FITC（MFI),-88-,流式临床应用发展,,白血病/淋巴瘤免疫分型,HIV感染的CD4绝对计数,CD34绝对计数/异体移植的免疫重建,抗原特异性T细胞检测树突状细胞（DC）循环微转移肿瘤细胞,I,II,III,IV,Marti GE, Maryalice SS, et al. Introduction to Flow cytometry. Seminars in Hematology, 2001;38(2):93-99,-89-,流式微球分析 Cytometric Bead Array（CBA）,-90-,CBA与ELISA相比优点“多元”和“同步”检测样本量少灵敏度相似稳定性好,
