1、甲胎蛋白对人肝癌 Bel 7402细胞 caspase信号传递及耐受 TRAIL的影响作者：李孟森，詹志农，周升，刘新华，李刚 【摘要】 目的 研究甲胎蛋白(AFP)对人肝癌 Bel 7402细胞内caspase信息通路信号传递的影响，以及对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导肝癌细胞凋亡的对抗作用。方法 激光共聚焦显微镜观察AFP与 caspase3 、caspase8 在 Bel 7402细胞内的共定位；免疫共沉淀(CoIP) 技术研究 AFP与 caspase3 、caspase8 的相互作用； RNA干扰(RNAi)技术封阻 AFP表达，并用 Western blotting
2、检测 RNAi干扰肝癌 Bel 7402细胞内 AFP表达的效果；用蛋白酶活性比色法检测 AFP对肝癌细胞 caspase3 、 caspase8 活性的影响； MTT法分析干扰AFP表达 30h后再给予 TRAIL(2nmol/L)处理 24h，Bel 7402细胞的生长情况，并用荧光显微镜观察经 TRAIL处理后肝癌细胞的凋亡状况。结果 共聚焦显微镜观察发现 AFP、caspase3 、caspase8 主要表达于 Bel 7402细胞的细胞质，发现 AFP能与 caspase3 共定位于细胞质，但与caspase8 在细胞质的共定位可能性很小；CoIP 技术研究发现 AFP能与 casp
3、ase3 结合，但不能与 caspase8 结合；2nmol/L 剂量的 TRAIL单独处理 Bel 7402细胞并不能显著改变 caspase3 活性，但能提升caspase8 活性，而用全反式维甲酸(ATRA)40mol/L 加 TRAIL(2nmol/L)处理时，则能提高 Bel 7402细胞 caspase3 活性；干扰 AFP表达后，单独用 TRAIL(2nmol/L)也能激活 caspase3 ，而干扰 AFP表达前后对caspase8 活性没有显著性改变；MTT 分析发现，2nmol/L 剂量的 TRAIL对 Bel 7402细胞的生长并没有显著性抑制作用，但是干扰 AFP表达后
4、TRAIL(2nmol/L)能明显抑制 Bel 7402细胞生长(抑制率为 48.4%)；荧光显微镜观察表明，干扰 AFP表达后 TRAIL(2nmol/L)能诱导 Bel 7402细胞凋亡。结论 AFP选择性抑制 caspase3 活性是阻断人肝癌 Bel 7402细胞内凋亡信息传递的重要机制，也是 AFP抵抗 TRAIL诱导肝癌细胞凋亡的关键环节。 【关键词】 甲胎蛋白；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；肿瘤耐药；肝癌细胞；caspase 信息通路ABSTRACT: Objective To explore the effects of alphafetoprotein (AFP) on th
5、e transduction of apoptotic signal in hepetocellular cancinoma cells (HCC) and the role of AFP in counteracting the apoptosis induced by tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand (TRAIL) of HCC. Methods Laser confocal microscopy was applied to observe the colocalization of AFP and caspas
6、e3 or caspase8. Coimmunoprecipitation (CoIP) was utilized to analyze the interaction of AFP with intracellular apoptotic signal molecules, caspase3 or caspase8. Short small RNA interfering (siRNA) technique was used to knockdown the expression of AFP in Bel 7402 cells. AFPs effect on the activity of
7、 caspase3 or caspase8 was detected by protease activity colorimetric methods. Bel 7402 cellsSupported by the National Natural Science Foundation of China (No.30660071, 30760090, 30671856, 30772536) and the Foundation of National Education Ministry for Graduate Program of China (No.20070001735) were
8、administered with TRAIL (2nmol/L) for 24h after knockdowning the expression of AFP by siRNA and the growth of the cells was analyzed by MTT or apoptosis of the cells was observed by fluorescence microscopy. Results AFP could interact with caspase3 in cytoplasm, but could not bind with caspase8. Trea
9、ted with all trans retinoic acid (ATRA) (40mol/L) plus TRAIL(2nmol/L) also enhanced the activity of caspase3 or caspase8, whereas treated with TRAIL(2nmol/L) alone for 24h, the activity of caspase8 was enhanced but the activity of caspase3 has not any change. AFP was able to inhibit caspase3 activit
10、y but it had little affect on the activity of caspase8 in vitro. When RNAi knockdowned the expression of AFP followed by treatment with TRAIL (2nmol/L), the activity of caspase3 was increased, but the activity of caspase8 remained the same as knockdown before. MTT detection showed that the growth of
11、 Bel 7402 cells was inhibited, the ratio was 48.4%, and apoptosis in nuclei of Bel 7402 cells was found to be induced when observed by fluorescence microscopy. Conclusion AFP can block the transduction of apoptotic signal by selectively inhibiting the activity of caspase3, and this is also the pivot
12、al event that AFP counteracts the apoptosis induced by TRAIL of hepatoma cells.KEY WORDS: alphafetoprotein; tumor necrosis factor related apoptosisinducing ligand (TRAIL); drug resistance in cancer; hepatocellular carcinoma cell; caspase signal transduction肝细胞癌是严重危害人类健康的重大疾病。我国是肝癌高发国家，由于肝炎和环境等因素的影响，
13、肝癌有逐年上升趋势，尽管临床上多采用手术和药物(化疗)治疗肝癌，但是由于肿瘤细胞的再生和转移以及肿瘤细胞对药物的耐受，导致治疗前景暗淡，所以揭示肝癌耐药的分子机制，将给肝肿瘤治疗带来新的希望。甲胎蛋白(alphafetoprotein, AFP)是肝癌细胞合成的特异性很高的蛋白质，很多肝癌患者(70%80%)在发病期间都有 AFP基因高表达的特征。AFP 是一种胚原蛋白，其基因在胎儿发育过程开放表达，而在人出生两年后基本处于关闭状态，但是成人发生肝癌或肝脏良性再生时，AFP 的基因重新被激活而大量表达，AFP在临床上被认为是肝癌的经典肿瘤标记物，因而 AFP被用作诊断肝癌的金标准。已经有大量研
14、究证明肝癌细胞分泌的 AFP具有促进肿瘤细胞增殖15 和诱导肿瘤细胞凋亡69 的双重作用。肝癌细胞在体内生存，必须逃避机体的免疫监控，耐受淋巴细胞等分泌的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)家族诱导凋亡。尽管已有研究发现 AFP具有促进肿瘤细胞增殖和对抗 TNF家族诱导凋亡4,1011 ，但对肝癌细胞分泌的 AFP在肝癌细胞耐受凋亡诱导过程中的具体作用知之甚少。在体内生理浓度的 AFP能促进肝癌细胞生长，肝癌细胞也由于分泌 AFP而能抑制淋巴细胞的攻击和诱导淋巴细胞凋亡，从而逃避免疫监视1012 。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF relatedapopto
15、sis inducingligand, TRAIL)被认为是很有开发前景的抗肿瘤的细胞因子1314 ，TRAIL 能通过与死亡受体(TRAIL 受体)结合，激发 caspase信号通路的级联反应而发挥其诱导肿瘤细胞凋亡作用，因而阻断 caspase信号传递是肿瘤细胞耐受 TRAIL或全反式维甲酸(all trans retinoic acid, ATRA)等化学药物诱导凋亡的重要方式1415 。作为肝癌细胞合成的特异性很高的蛋白质，AFP 在对抗细胞因子和化学药物等诱导凋亡中的作用及是否为肝癌细胞抗凋亡诱导的重要物质等问题，是认识肝癌细胞发生过程中为何高表达 AFP的核心环节。本研究分析 AF
16、P在人肝癌 Bel 7402细胞内对 caspase3 、caspase8 活性的影响，探索 AFP对凋亡信号传递的调控作用及其对抗 TRAIL诱导凋亡的一些分子机制。1 材料与方法1.1 细胞系和蛋白质材料 人肝癌 Bel 7402细胞由北京大学医学部细胞生物学系提供；AFP 纯品(code：A32260H，从肝癌细胞中提取)购自 Biodesign 公司；重组人的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor relatedapoptosis inducingligand, TRAIL/Apo2L，code: 31004) 购自 PeproTech EC. LTD
17、(USA)；小鼠抗人AFP的单克隆抗体(code: T2) 和兔抗人 caspase3(code: 50)多克隆抗体购自 Perfe Scientific公司(USA)，小鼠抗人 Actin(code: sc1616) 单克隆抗体、Western blotting luminol reagent(code: sc2048) 购自 Santa Cruz公司(California, USA)；兔抗人caspase8 多克隆抗体(code: MS1143P0) 为 Lab Vision Corporation(USA)产品；二抗为辣根过氧化物酶连接的羊抗小鼠、羊抗兔多克隆抗体、FITCconjuga
18、ted(code: 66288) 羊抗兔和TRITCconjugated(code: 61551) 羊抗小鼠二抗为 Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc(Baltimore, PA, USA)的产品；RNA干扰试剂盒 pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector Kit (code: E07/F07) 购自上海吉玛制药技术有限公司；All trans retinoic acid (ATRA，code: 98F0178) 为 Sigma产品。1.2 细胞培养 用含有 100mL/L小牛血清的 RPMI1640 培养基(GIB
19、COBRL公司产品)培养人肝癌 Bel 7402细胞，待细胞长到 90%融合时，用 2.5g/L的胰蛋白酶消化细胞，100mL/L 小牛血清的 RPMI1640 培养基吹散细胞，把细胞调整到一定的数目，进行以下的实验研究。1.3 激光共聚焦显微镜技术研究蛋白质的细胞内定位 20mm20mm的盖玻片经过洁净处理，高温、高压消毒后放置到 6孔细胞培养板中，然后加入用 RPMI1640( 含有 100mL/L胎牛血清)调整到2.0104个/mL 的细胞悬液 2mL，待细胞长到 70%融合，用 40g/L多聚甲醛固定细胞 30min，再用 3mL/L的 TritonX 100浸泡细胞 30min，去掉
20、全部液体，用 1mL PBS清洗细胞 3次，去掉全部液体，用 50mL/L的胎牛血清封闭细胞 1h，去掉封闭液，加入小鼠抗人AFP 的单克隆抗体(抗体浓度为 1100)和兔抗人caspase3 或 caspase8 的多克隆抗体(抗体浓度为 1100)，4轻摇 12h，去掉一抗液体，用 1mL PBS清洗细胞3次，加入 TRITC标记的羊抗小鼠二抗和 FITC标记的羊抗兔二抗液1mL(PBS配制)，室温轻摇 2h(避光)，再加入 10L 浓度为 100g/mL DAPI(终浓度为 10g/mL)，室温轻摇 30min(避光)，去掉全部液体，用1mL PBS清洗细胞 3次，用 Olympus F
21、luoview FV1000(Japan)型激光共聚焦显微镜观察标记结果并分析荧光分子在细胞内共定位、拍摄图像。1.4 免疫共沉淀技术分析蛋白质相互作用 Bel 7402细胞用RPMI1640( 含 100mL/L胎牛血清)调整到 2.0104个/mL，5mL 细胞液培养于 33cm2的培养瓶，每组设 2个平行瓶，细胞培养 24h后，去掉培养液，换成含有 100mL/L血清和含有 ATRA(40mol/L)加 TRAIL(2nmol/L)浓度的 RPMI1640 处理细胞 24h，提取细胞蛋白质，蛋白质分 4份，其中 1份做 Input，剩下的 3份分别用抗 AFP单克隆抗体、caspase3
22、 或caspase8 的单克隆抗体和兔免疫血清(IgG)沉淀目标抗原，然后用protein Aagarose( 碧云天生物科技研究所产品，江苏)把抗原抗体复合物吸附到 agarose珠子上，并离心清洗其他蛋白质，再用上样缓冲液和高温煮沸方法使 agarose珠子与蛋白质复合物分离，经过SDSPAGE( 聚丙烯酰氨凝胶电泳)把抗原和抗体分离，Western blotting杂交分析相关抗原，用 FUJI 公司(Japan)LAS3000 型化学发光/荧光仪拍摄杂交蛋白质条带。1.5 RNA干扰技术封阻 AFP表达和 Western blotting检测干扰效果 20mm20mm 的盖玻片经过洁净
23、处理，高温、高压消毒后放到 6孔培养板中，然后加入用 RPMI1640( 含有 100mL/L胎牛血清)把 Bel 7402细胞调整到 2.0104个/mL 的细胞悬液 2mL，待细胞长到 70%80%融合，转染已经构建有 siRNAAFP 序列的 pGPU6/GFP/Neo质粒，干扰 AFP的三个序列分别为：序列 1 Sense: GTTG AATG CTTC CAAA CAA, Antisense: TTGT TTGG AAGC ATTC AAC(称为 AFP 593siRNA) ，序列 2 Sense: GCAG CTTG TTAA ATCA ACA； Antisense: TGTT G
24、ATT TAAC AAGC TGC(称为AFP645siRNA) ；序列 3 Sense: GAAC GTGG TCAA TGTA TAA；Antisense: TTAT ACAT TGAC CACG TTC(称为 AFP 923siRNA) ；阴性对照序列 Sense: GTTC TCCG AACG TGTC ACG；Antisense: ACGT GACA CGTT CGGA GAA(称为 NCVector) 。用 LipofectamineTM 2000 (Invitrogen 公司产品)促进转染，待转染 12h后，去掉全部液体，用含 100mL/L胎牛血清的RPMI1640 培养细胞
25、18h后，取出盖玻片，置于载玻片上，用荧光显微镜观察转染效率。Bel 7402细胞用含 100mL/L胎牛血清的 RPMI1640调整到 2.0104个/mL，5mL 细胞液培养于 33cm2的培养瓶，每组设 2个平行瓶，待细胞培养 70%80%融合后，转染已经构建有 siRNAAFP 序列的 pGPU6/GFP/Neo质粒，用 LipofectamineTM 2000促进干扰载体转染细胞，待转染 12h后更换新的培养液再培养细胞 18h，按 Western blotting杂交分析方法提取细胞蛋白质并分析 AFP表达。1.6 蛋白酶活性比色法分析 caspase3 和 caspase8 活性
26、1.6.1 细胞外的 AFP对人肝癌 Bel 7402细胞内 caspase3 和caspase8 活性的影响 人肝癌 Bel 7402细胞按 1.0105个/mL，培养于 33cm2培养瓶中，每组设 3个平行瓶，每瓶 5mL，待细胞长到 70%80%融合，饥饿细胞(用不加血清的培养液)24h 后换成含 100mL/L小牛血清的培养液培养 12h，加入 TRAIL(2nmol/L)和 ATRA(40mol/L)共同处理 24h后，收集细胞，按测定 caspase3 活性试剂盒(APOPCYTO caspase3 Colorimetric Assay Kit，Medical Biological
27、 Laboratories CO., LTD, Japan)和 caspase8 活性测定试剂盒(caspase8 Colorimetric Activity Assay Kit, Chemicon International, Inc, CA, USA)的操作说明裂解细胞，提取蛋白质。即经过药物处理后的人肝癌细胞，用试剂盒提供的细胞裂解缓冲液提取细胞内的蛋白质，考马斯亮蓝法测定蛋白含量，蛋白质浓度调整到 23mg/mL，把相同蛋白量加到96孔平底酶标板(或细胞培养板)，每组设 3个平行孔，然后按照要求加入相应的反应底物、AFP 纯品(先与提取的蛋白酶在 4混合 30min，AFP的终浓度为
28、1g/mL)、抗 AFP的单克隆抗体(mAb，终浓度为 2g/mL)、酶活性抑制物等，充分混匀，避光置于 37保温 36h。1.6.2 细胞内的 AFP对人肝癌 Bel 7402细胞 caspase3 和caspase8 活性的影响 Bel 7402细胞用含 100mL/L胎牛血清的RPMI1640 调整到 2.0104个/mL，5mL 细胞液培养于 33cm2的培养瓶，每组设 3个平行瓶，待细胞培养 70%80%融合后，转染已经构建有siRNAAFP 序列的 pGPU6/GFP/Neo质粒，用 LipofectamineTM 2000促进干扰载体转染细胞，待转染 12h后更换新的培养液再培养
29、细胞 18h，再用TRAIL(2nmol/L)处理 12h，TRAIL(16nmol/L)作为阳性对照组，按检测caspase3 和 caspase8 活性试剂盒的说明裂解细胞，提取蛋白质，并按以上测定 caspase3 、caspase8 活性的方法分组，加入酶反应底物或抑制物，避光 37孵育 36h 后，用 BioTek Instruments 酶标仪在波长 405nm测光密度(A405)。酶相对活性=(对照组 A405-处理组 A405)/ 对照组 A405100%。1.7 MTT法检测干扰 AFP表达后 Bel 7402 细胞对 TRAIL的敏感性 Bel 7402细胞被转染 AFPs
30、iRNA 载体 30h后，2.5g/L 胰蛋白酶消化细胞，再用含有 100mL/L小牛血清的 RPMI1640 培养液吹散细胞，调整细胞数目为 2.5104个/mL，培养于 96孔培养板中，每孔 120L，每组设 8个平行孔，适应培养 24h后，细胞被饥饿 12h(用不加血清的培养液)，换成含 100mL/L小牛血清的培养液培养 12h，加入各种浓度的TRAIL(2、16nmol/L)，处理 24h后，每孔加入 16L 的 MTT(5g/L)，37孵育 4h，去掉所有的液体，用 PBS(pH 7.4)液洗 3次后，去掉 PBS液，每孔加入 120L 二甲基亚砜，微震荡仪震荡 30min，酶标仪
31、 570nm测吸光度(A)。A 值越大表示细胞生长越旺盛。1.8 DAPI染色检测干扰 AFP表达后 TRAIL诱导 Bel 7402 细胞凋亡 用含有 100mL/L胎牛血清的 RPMI1640 把 Bel 7402细胞调整到2.0104个/mL，2mL 细胞悬液培养于 6孔细胞培养板中，待细胞长到 80%融合，Bel 7402细胞被转染已经构建有 AFP923siRNA 序列的pGPU6/GFP/Neo质粒，待转染 30h后加入 TRAIL(2、16nmol/L)处理 24h后，然后收集悬浮细胞到离心管，再用 2.5g/L胰蛋白酶消化贴壁细胞，用 1.5mL PBS把细胞轻轻吹下，收集到装有悬浮细胞的离心管中，离心(1000r/min, 5min)，去掉 PBS，用 1mL PBS把细胞轻轻吹散，加入10L 浓度为 100g/mL DAPI，避光 37保温 30min，离心(1000r/min,
