1、1,第二章 氨基酸分析,2,苯丙酮尿症（PKU）是一种常见的氨基酸代谢病，是由于苯丙氨酸（Phe）代谢途径中的酶缺陷，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸蓄积，并从尿中大量排出。 本病在遗传性氨基酸代谢缺陷疾病中比较常见，其遗传方式为常染色体隐性遗传。临床表现不均一，主要临床特征为智力低下、精神神经症状、湿疹、皮肤抓痕征及色素脱失和鼠气味等、脑电图异常。如果能得到早期诊断和早期治疗，则前述临床表现可不发生，智力正常，脑电图异常也可得到恢复。,苯丙酮尿症（PKU）,3,病因: 苯丙氨酸是人体必需的氨基酸之一。正常人每日需要的摄入量约为200500毫克，其中1/3供合成蛋白，2/3
2、则通过肝细胞中苯丙氨酸羟化酶（PAH）的转化为酪氨酸，以合成甲状腺素、肾上腺素和黑色素等。苯丙氨酸转化为酪氨酸的过程中，除需PAH外，还必须有四氢生物蝶呤（BH4）作为辅酶参与。基因突变有可能造成相关酶的活性缺陷，致使苯氨酸发生异常累积。治疗:主要是饮食疗法。开始治疗的年龄愈小，效果愈好。,苯丙酮尿症（PKU）,1. 氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子质量在75200Da之间，其化学通式为R-CH(NH2)-COOH，在生物体内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微生物来源的多肽中出现D型氨基酸。2. 氨基酸分析技术的发展始于1820年，由Braconnot最早将甘氨酸从白明胶水解物中分离出来。3
3、. 色谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。1941年，Martin等运用色层法分析氨基酸，主要采用乙酰化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量；随后，Moore、Stein应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸，在1958年，Spackman、Stein、Moore制造了自动化的氨基酸分析仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段，至今仍是经典的方法。,氨基酸分析,组成蛋白质的20种氨基酸除甘氨酸外、都有一个不对称碳原子，即-碳原子。-碳原子有四个不同取代基：羧基、氨基、氢原子和R基团，不同氨基酸的R基团不同。每种氨基酸有D-构型和L-构型，蛋白质中的氨基酸都是L-构型。,氨基酸的基本结构及性质,6
4、,氨基酸的基本结构及性质,氨基酸是分子中含有氨基和羧基的一类化合物。组成蛋白质的氨基酸只有二十种。其中有八种为人体必需氨基酸。人体必需的氨基酸：人体内不能合成，只有靠食物供给的氨基酸。各种蛋白质含氨基酸的种类和数量都各不相同。,7,20种氨基酸的中英文名称及缩写,人体必需氨基酸,2、几种常见的氨基酸,名称,俗称,结构简式,氨基乙酸,-氨基丙酸,-氨基-苯基丙酸,-氨基戊二酸,甘氨酸,丙氨酸,谷氨酸,苯丙氨酸,10,氨基酸的分类,1、根据氨基酸的酸碱性,11,酸性氨基酸,二个羧基一个氨基,天冬氨酸谷氨酸,碱性氨基酸,一个羧基二个或二个以上氨基,赖氨酸精氨酸组氨酸,中性氨基酸,一个羧基一个氨基,实
5、际水溶液呈弱酸性： 电离能力 COOH NH2,12,2、根据氨基酸的化学特性,疏水性：Ala Val Leu Ile Phe Pro Met带电：Arg Lys Asp Glu (His)极性：Ser Thr Cys Asn Gln His Tyr Trp特殊：Gly (Pro),氨基酸的分类,13,带电氨基酸,14,极性氨基酸,15,氨基酸的立体化学,由蛋白质水解的氨基酸都为-氨基酸，除甘氨酸外，所有- C都为手性碳原子。 天然的氨基酸均为L-氨基酸,16,-CDEP修饰的Fe3O4磁微球用于手性化合拆分,图3.9 不同功能化磁微球作用dl-色氨酸后毛细管电泳分离图 (A) 以及相对应的峰
6、面积图(B)，(a) 0 , (b) 100, (c) 200, (d) 300 mg,17,氨基酸的理化性质,1. 溶解度2. 熔点:高3. 旋光性有旋光性4. 味感：D-氨基酸大多带甜味，L-氨基酸有苦、甜、鲜、酸等四种不同味感。,1. 两性性质：氨基酸分子中含有氨基及羧基，使其既能象酸又能象碱一样解离；2. 与甲醛作用：3. 与2,4-二硝基氟苯作用：4. 与茚三酮的作用：5. 与异硫酸苯酯的作用：6. 与荧光胺的作用：7. 与5,5-双硫基-双(硝基苯甲酸)反应,18,等电点,概念：将氨基酸水溶液的酸碱度加以适当地调节，使氨基酸的酸性电离程度与碱性电离程度相等。此时，氨基酸带有的正电荷
7、数目和负电荷数目相等，此溶液的pH值称为氨基酸的等电点，用 pI 表示。在等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀等电点可用酸碱滴定方法测定，也可通过pK值计算侧链无解离基团时：pI=(pK1+pK2)/2侧链有解离基团时, pI相当于氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK值和的一半,19,pH = pI,净电荷为零,在电场中不移动,pH pI,带负电荷,等电点,要使氨基酸达到等电状态：中性氨基酸： pI pH 7 加碱,20,与茚三酮的显色反应,水合茚三酮,CO2,21,蓝紫色化合物,根据CO2的量或蓝紫色的深浅程度 作为-氨基酸定量分析的依据。,与茚三酮的显色反应,22,氨基酸的斑点分析, 大多数
8、氨基酸不含有特征发色基团。因此，氨基酸的分析依赖于衍生化反应。对衍生化试剂的要求是反应快，并且 产物与试剂本身的光谱性质有明显的差异。常用的衍生化试剂有2，4-二硝基氟 苯、荧光胺及邻苯二甲醛等。根据产物性质的不同，衍生化试剂可分为显色剂及荧光衍生化试剂两大类。,23,斑点显色分析法, 茚三酮是氨基酸的斑点显色分析中非常简单的衍生化试剂。 它可以与一级和二级胺在酸性介质中pH（34）加热反应，反应产生氨、二氧化碳和蓝-紫色的络合物。一级和二级胺的检测波长分别为570和440nm。若二者同时存在，一般在500 nm处测定，灵敏度有所降低。,24,另一种常用的显色反应试剂是2，4-二硝基氟苯，它可
9、以与样品中氨基酸及一级和二级胺反应，生成黄色络合物，检测波长在420nm。该法测定的是氨基酸的总量。,斑点显色分析法,25,斑点荧光分析法,荧光胺是用于氨基酸分析的高灵敏荧光衍 生化试剂，可用于氨基酸的表面分析，如 薄层色谱。邻苯二甲醛（OPA）是用于氨基酸荧光分 析的另一种常见的衍生化试剂。,26,色谱方法测定氨基酸,离子交换色谱法反相色谱分析法液相色谱-质谱法毛细管电泳法气相色谱法,27,离子交换色谱法,离子交换色谱的基本原理是基于带电荷的阴阳离 子与带相反电荷的离子交换基团的相互作用。氨基酸、肽和蛋白质在溶液中带电荷，可与离子 交换基团产生静电作用而保留。其固定相应具有分离效能高、物化性
10、质稳定、柱 容量大、分辨率高、能快速保持生物分子活性和 构象完好。,28,阳离子交换树脂：强酸型磺酸化的 聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。阴离子交换树脂：只有在特殊情况下 用于强酸性氨基酸的分析。,离子交换色谱法,29,1、直接检测法,离子交换色谱法用于氨基酸分析时，可在200nm处对各种氨基酸进行直接检测，检出限在110 pmol之间。,30,（1）选择性差：生物样品中多种内源 性成分在200 nm处均有吸收；（2）背景高：HPIC常用的各种溶剂在 200 nm处也有吸收。,直接检测的缺点,31,2、柱后衍生化法,衍生化是将氨基酸衍生为有利于测定或分离的化合物。大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，
11、无法直接用紫外法检测，需要先将氨基酸衍生为具有较强紫外或荧光吸收的衍生物。为了提高灵敏度及选择性，一般采用柱后衍生化，再用紫外或荧光法对产物进行检测。常用衍生化试剂：茚三酮、邻苯二甲醛、荧光胺。,32,柱后衍生化法的优点,1、几乎不需要样品处理步骤，蛋白质水解产物可以直接进样分析；2、反应产物与副产物的混合物无需分离；3、离子色谱柱的稳定性高，因而样品间的重现性好；4、反应无需完成，产物也可以是多种。只要混合时间及反应产物的比例是一定的，则分析的重现性就不会受到影响。5、对反应产物的稳定性要求低，因为反应及检测几乎是同时进行的。,33,氨基酸分析仪,原理：采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱
12、后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。 两种系统：蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸分析系统（锂盐系统），利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸；锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸。 分析效果：灵敏度（最低检测限）比HPLC柱前衍生方法稍低以外（HPLC：0.5pmol；氨基酸分析仪：10pmol)，其他如分离度、重现性、操作简便性、运行成本等方面，都优于其他分析方法。,35,氨基酸分析仪,日立7180全自动生化仪,样品的制备,（一）蛋白质的水解（二）游离氨基酸样品的制备（三）生理体液样品的前处理,（一）蛋白质的水解
13、,用于全氨基酸测定的样品，凡是以蛋白质形式存在的都要进行水解处理，水解方法有三种：1、酸水解法：标准水解法，水解彻底，但色氨酸被破坏。2、碱水解法：用NaOH作为水解剂，色氨酸不被破坏，但有消旋作用，丝氨酸、苏氨酸等被破坏。3、酶水解法：水解条件温和，无需特殊设备，氨基酸不受破环，但水解时间长，而且不易水解完全。,（二）游离氨基酸样品的制备,游离氨基酸的样品在分析前必需进行磨碎、脱脂、提取、脱盐、去蛋白、脱色等处理。在进行分析前建议使用C18小柱处理一下。,（三）生理体液样品的处理,生理体液的样品首先要除去样品中的蛋白质，获得游离氨基酸。除去蛋白质化学方法为： 1、苦味酸法 2、三氯乙酸法 3
14、、乙醇沉淀法 4、磺基水杨酸法（常用的方法）,41,反相色谱分析法,反相色谱法是以表面非极性载体为固定 相，以极性溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式。反相色谱分析法的效率比离子色谱法高；用于氨基酸分析一般采用柱前衍生化。衍生化不仅可以提高氨基酸被检测的信号强度，而且可以提高氨基酸的疏水性，从而可以用反相色谱法进行分离。,42,HPLC法测定复合氨基酸胶囊中氨基酸的含量,43,HPLC法测定复合氨基酸胶囊中氨基酸的含量,44,45,HPLC-蒸发光散射法,46,反相高效液相色谱法与离子交换色谱法测定氨基酸对比,47,反相高效液相色谱法与离子交换色谱法测定氨基酸对比,48,反相高效液相色谱法与离子
15、交换色谱法测定氨基酸对比,49,液质联用法,大多数氨基酸本身不具有紫外吸收, 也不发射荧光, 不能直接检测； 传统的氨基酸分析方法为离子交换色谱法, 该方法操作繁琐, 成本高;目前多用反相高效液相色谱法, 分析周期至少需要半小时以上, 后来发展起来高效毛细管电泳法。 虽然有较大改进, 但仍需要采用化学衍生技术及梯度洗脱以提高其分离、检测性能, 衍生化的缺点是费时费力而且损害准确性, 而且 完全依靠保留时间来定性, 准确度不高；LC -MS联用技术利用三级四极质谱仪的分离和定性能力, 提供了可靠的、精确的相对分子量和结构信息, 显著提高了准确度、灵敏度, 操作非常简单 , 节省了样品准备时间和分
16、析时间。,50,液质联用法,51,液相色谱 -质谱联用技术分析18种游离氨基酸,52,53,毛细管电泳具有微量、灵敏和柱效高的 特点，适合于氨基酸手性分离和复杂样 品中的氨基酸分析。用于氨基酸分析的毛细管电泳主要采用 两种分离模式：毛细管区带电泳和胶束电动毛细管电泳。检测方式主要有紫外法和荧光法。,毛细管电泳法,54,毛细管电泳法可以进行柱前、柱内和柱后衍生化。柱内衍生化要求反应速度快，一般采用串联或 “夹心饼”两种形式，具有试剂和样品用量少的 优点。柱后衍生化可以避免柱前或柱内衍生化时其他 化合物对衍生反应的干扰，缺点是柱后反应装 置体积大，会引起色谱峰变宽而降低分离效果。,毛细管电泳法,5
17、5,毛细管电泳法快速测定血清中游离氨基酸,56,毛细管电泳法快速测定血清中游离氨基酸,57,毛细管电泳法快速测定血清中游离氨基酸,58,气相色谱法,气相色谱法分析氨基酸具有分离时间短、 柱效高、容易和质谱联用等优点。氨基酸含有羧基、羟基、氨基和硫基等极 性基团，需要先对其衍生化。,59,两步法是先将羧基用短碳链脂肪醇酯化， 然后再用各种酸酐将N-（O、S）基团乙酰 化。一步法是用烃基氯甲酰酯在水、醇类和吡 啶介质中将氨基酸一步衍生化生成烃基碳 氧酰烃基酯。,衍生化方法,60,氨基酸选择性反应的分析方法,1、显色分析法2、荧光法3、微生物方法4、酶分析法,61,显色分析法,有几种显色试剂只有当干
18、扰物预先除去后才有定量分析的价值。 在有些情况下可以通过改变试剂的组成或反应条件以便进行某一种氨基酸的选择性测定。,62,荧光法,色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等在紫外光照射下会产生荧光，其它氨基酸与某些有机试剂反应之后其产物才会产生荧光。相对于显色法，荧光分析法的选择性和灵敏度要好。,63,微生物方法,微生物方法用于氨基酸分析的原理是：有些微生物的生长和复制需要特定氨基酸的存在。在有限量的氨基酸存在下微生物的生长将受到限制。利用浊度分析法或测定乳酸生成量的增加可对微生物的生长进行评价。微生物方法适合于各种生物样品，可用于大量样品的批量分析，而且分析耗费低。,64,酶分析法,一种酶对氨基酸某一种异构
19、体的特异性可 以用于D或L型氨基酸的测定。在这一应用 中氨基酸氧化酶非常有用。,65,存在的问题及发展趋势,氨基酸分析中最主要的问题是来自环境的氨基酸的干扰；微量氨基酸的分析仍然是一个富有挑战性的课题；氨基酸构型分析及手性拆分也是国内外研究的热点。,66,研究应用-测定血浆中氨基酸,67,研究应用-口服水解蛋白成分分析,68,研究应用-羊肉氨基酸成分分析,69,研究应用-鱼肉中氨基酸含量分析,70,研究应用-慢性肝病研究,思考： 分析多肽的结构特点，思考为什么蛋白质的种类如此丰富？,练习题： 有2个甘氨酸和2个丙氨酸，发生成肽反应，能有几种产物？,思考题： 有3个甘氨酸和3个丙氨酸，发生成肽反应，能有几种产物？,本章作业：,茚三酮是鉴定氨基酸的最简便方法，查阅文献，写一篇利用茚三酮鉴定氨基酸在实际应用中的小论文。,
