1、甲状腺肿瘤检测 Bcl-2 的意义【摘要】 目的 探讨 Bcl-2 的表达与甲状腺癌的发生、发展及预后的关系。方法 应用免疫组化方法，以单克隆抗体鼠抗人 Bcl-2 标记 77例甲状腺癌、58 例甲状腺腺瘤、40 例癌旁甲状腺组织和 28 例正常甲状腺组织。观察不同甲状腺组织中 Bcl-2 的表达，并比较其阳性率。结果 Bcl-2 阳性反应见于甲状腺癌、甲状腺腺瘤及癌旁甲状腺组织。在甲状腺癌组织中 Bcl-2 阳性率为 45.5，高于甲状腺腺瘤组织(22.4)(P=0006)、癌旁甲状腺组织(17.5)(P=0003)和正常甲状腺组织(0)(P=0000)。甲状腺未分化癌和滤泡状癌组织中 Bc
2、l-2 的阳性率明显增高。存在淋巴结转移和临床、期病例中，Bcl-2 的阳性率明显增高。结论 Bcl-2 过量表达可能与甲状腺肿瘤的发生有关，癌组织中 Bcl-2 的表达可作为甲状腺癌预后的参考指标。 【关键词】 甲状腺肿瘤；Bcl-2 基因；原癌基因；基因表达；免疫组化 甲状腺癌是常见的内分泌肿瘤，女性发病率高。临床甲状腺肿瘤中有 510为甲状腺癌1 。其中分化型甲状腺癌占 90，包括甲状腺乳头状癌和甲状腺滤泡状癌，未分化癌较为少见，其恶性程度高、预后差。国内资料显示我国甲状腺癌的发病率在明显增加2 。近年来，甲状腺癌的相关基因和肿瘤标志物研究进展很快。研究证实3,4 ，Bcl-2 基因是一
3、种细胞凋亡抑制基因，最早发现于滤泡性 B 细胞性淋巴瘤中，其产物 Bcl-2 蛋白可抑制细胞凋亡，延长细胞生存期。本研究采用免疫组化技术，通过检测 Bcl-2 在甲状腺癌组织、甲状腺腺瘤组织、甲状腺癌旁组织及正常甲状腺组织中的表达水平，探讨 Bcl-2 在甲状腺癌组织中的发生发展过程中的作用，以揭示 Bcl-2 与甲状腺癌的生物学行为的关系及其预后关系。 1 材料与方法 1.1 材料 全部标本取自北京大学深圳医院普通外科 2001 年至 2009 年间手术治疗的甲状腺病例标本，其中：甲状腺癌 77 例(男 28 例，女 8 例，平均50 岁)，58 例甲状腺腺瘤(男 22 例，女 36 例，平
4、均 36 岁)，同时取癌旁甲状腺组织 40 例(男 10 例，女 30 例，平均 37 岁，经病理检查确诊均无甲状腺癌浸润)；取正常甲状腺组织 28 例(男 9 例，女 l9 例，平均 35 岁)。对 77 例甲状腺癌按 WHO 标准组织学分类：乳头状癌 55 例，滤泡状癌 l4例，未分化癌 8 例，按 AJCC 标准临床病理分期：I 期 30 例，期 23 例， 期 16 例，期 8 例；其中，有淋巴结转移者 33 例，无淋巴结转移者44 例。标本经 10 福尔马林液固定、石蜡包埋，常规切片，60烤片 2 h，37过夜备用。 1.2 免疫组化试剂 Bcl-2 鼠抗人单克隆抗体，为美国 ZYM
5、ED 公司产品。SP-9000 通用型试剂盒为美国 ZYMED 公司产品。用已知 Bcl-2 阳性的扁桃体作阳性对照，以 PBS 代替一抗作阴性空白对照。 1.3 试验方法 切片脱蜡水化后，3H2O2 室温处理 15 min，微波抗原修复，正常山羊血清室温孵育 30 min，滴加一抗，4冰箱孵育过夜。滴加生物素标志的二抗，室温孵育 30 min，滴加辣根过氧化酶标记的链亲和素室温 30 min，DAB 显色。经苏木精复染后，脱水、透明、封片。 1.4 判断标准 Bcl-2 定位于细胞膜及细胞质，以细胞膜及细胞质内出现黄色至深棕黄色颗粒为阳性细胞。无阳性细胞为 Bcl-2 阴性；有阳性细胞为 B
6、cl-2 阳性。所有标本均由两位病理医师采用盲法阅片，结果不一致时协调统一判断最终结果。 1.5 统计学分析 所有数据采用 SPSS 13.0 统计软件包在电脑上进行统计分析，进行.2 检验，以 P0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 Bcl-2 在不同甲状腺组织中的表达情况,见表 1。 光镜下 Bcl-2 阳性反应表现为细胞膜及细胞质染成棕褐色，未见棕褐色颗粒为阴性。Bcl-2 阳性率在甲状腺癌为 45.5，高于甲状腺腺瘤(22.4)(P0.01)及癌旁甲状腺组织(17.5)(P0.01)，而正常甲状腺组织染色阴性。见表 1。 2.2 甲状腺癌中 Bcl-2 表达与甲状腺癌有关病
7、理指标的关系，见表2。Bcl-2 的表达程度与甲状腺癌组织学类型、淋巴结转移情况和临床病理分期有显著关系。在恶性度较高的未分化癌和滤泡状癌中，Bcl-2 阳性率明显高于恶性度较低的乳头状癌；在有淋巴结转移病例或临床 、期病例，Bcl-2 阳性率高于相应的无淋巴结转移和临床 I、期病例，差异均有统计学意义(P0.01)。3 讨论 细胞凋亡又称细胞程序化死亡，受基因调控，调控基因大体分为凋亡抑制基因和凋亡促进基因，二者此消彼长，共同调节细胞的凋亡， 对其研究将是解决细胞凋亡机制的根本。但迄今为止其确切作用机制仍不完全清楚。 bcl-2 基因家族在凋亡的调节中起重要作用，是研究热点之一。Bcl-2
8、基因即 B 细胞淋巴瘤/白血病基因-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)，是 Tsujimoto 等5于 1984 年首次在滤泡型 B 淋巴瘤中发现，由此命名 Bcl-2。正常位于 18 号染色体的长臂 2 区 1 带，开始是通过染色体易位(14，18)断裂点的分子克隆方法，从滤泡型淋巴细胞瘤中分离出来的，被人们认为是人类滤泡型淋巴细胞瘤的细胞遗传学标志，由 2 个外显子组成，其基因产物在人类中的表达与细胞寿命长短相关。近年来，人们通过广泛的研究发现，Bcl-2 基因有阻滞细胞凋亡发生的作用，故被认为是抗细胞凋亡基因6 。其抑制凋亡的机制，以前报道笼统说通过阻止细胞凋亡信
9、号传输的最后共同通路而起作用。通过对 bcl-2 结合蛋白和bcl-2 同源蛋白的研究，对 bcl-2 家族调控凋亡的基本模式有了新的认识。bcl-2 同源蛋白包括 bcl-2、bcl-xL、bax、bad 以及线虫的 ced-9，bcl-2、bax 可以以同二聚体形式存在，也可形成异二聚体，bax 同源二聚体形成，诱导凋亡，bax-bcl-2 异二聚体形成，抑制凋亡；而当 bcl-xs 存在时，优先与 bcl-2 形成异二聚体，使 bax 得以游离形成同二聚体，诱导凋亡，因此，有时 bcl-2 表达并不一定抑制细胞凋亡的发生。一般认为，bcl-2 基因表达与瘤细胞的分化程度及增殖能力有关，分
10、化程度低，增殖能力强的瘤细胞，其 bcl-2 呈现出过量表达趋势。本研究中，作者系统地检测了甲状腺癌组织、甲状腺腺瘤组织、甲状腺癌旁组织及正常甲状腺组织等多种甲状腺组织中 Bcl-2 的表达情况，显示在甲状腺癌组织 Bcl-2 的表达率为 45.5，显著高于甲状腺腺瘤组织(22.4，P=0.006)、甲状腺癌旁的组织(17.5，P=0.003)及正常甲状腺组织(0，P=0.000)，揭示出甲状腺腺瘤的滤泡上皮细胞 bcl-2 阳性染色强度及阳性细胞数较正常甲状腺滤泡上皮细胞增强增多，甲状腺癌又超过腺瘤，提示 bcl-2 可能在调节甲状腺上皮的凋亡中伴演重要角色，在甲状腺癌中有更多的上皮细胞具有
11、逃避凋亡的能力，甲状腺癌的发生可能与 bcl-2 过量表达有关。研究表明，对于甲状腺癌，肿瘤组织学类型、年龄、淋巴结转移情况及临床病理分期是评估预后的主要指标7、8 。本组研究结果表明，在分化程度很低的未分化癌和相对较低的滤泡状癌中，Bcl-2 的表达率分别为 100与 78.6，明显高于乳头状癌Bcl-2 的表达率(29.1)，差异均具有统计学意义；在有淋巴结转移的病例或 III、IV 期甲状腺癌病例中，癌组织中 Bcl-2 的表达明显增强，差异均具有统计学意义。Bcl-2 在甲状腺癌所有类型中均有表达，并且分化越差表达程度越高，因此，有理由认为，Bcl-2 阳性提示甲状腺癌预后较差，并且表
12、达程度越高预后也就越差。癌组织 Bcl-2 高表达与甲状腺癌的分化程度、组织学亚型、增值侵袭能力、淋巴结转移以及预后有关，可作为判断甲状腺癌预后的一个重要参考指标。因此，对于甲状腺腺瘤患者，作肿瘤组织 Bcl-2 检测并对阳性病例进行密切随访可能具有重要意义。参考文献 1 Hegedus LClinical practice：the thyroid noduleN Engl J Med，2004，351(17)：1764-1771 2 关海霞，单忠艳，米小轶，等普通食盐碘化前后甲状腺癌发病变化的 11 年病理资料分析中国医科大学学报，2006，35(3)：284-285. 3 Soda G，A
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