1、结核分枝杆菌 furB 基因的克隆、表达和纯化作者：姜泓，薛莹，高雪，师长宏，柏银兰，张海，李元，徐志凯 【关键词】 结核分枝杆菌 【Abstract】 AIM: To obtain Mycobacterium tuberculosis (MTB) furB from H37RvDNA, express efficiently in E. coli and purify the FurB proteins. METHODS: furB was amplified by PCR from the genome of H37Rv and cloned into pGEMTEasy vector.
2、After sequenced, furB was recombinated into the expression vector pQE80L by restriction enzyme digestion, which was named pQE80LfurB. The plasmid pQE80LfurB was transformed into E.coli DH5 and induced by IPTG. The furB expression was analyzed by SDSPAGE and confirmed by Western blot with micespecifi
3、c mAb against (His)6. RESULTS: furB was identical to what reported by Genbank. The pQE80LfurB vector expressed protein with relative molecule mass 15.0103, which could be caught by (His)6 mAb. The expressed protein could be purified by NiNTA system kit with denatured condition. CONCLUSION: furB has
4、been successfully cloned and efficiently expressed in E.coli, The results lay the basis for further study of FurB functions. 【Keywords】 furB; expression; purification; Mycobacterium tuberculosis 【摘要】 目的： 从 H37Rv 基因组中扩增 furB 并高效表达和纯化. 方法： 用 PCR 技术从结核分枝杆菌 H37Rv 基因组中扩增 furB 序列，将其与 pGEMTEasy 载体连接转化 E.co
5、li DH5，构建重组克隆载体pGEMTEasy/furB，测序正确后将目的基因片断克隆入 pQE80L 原核表达载体并转化 E.coli DH5，IPTG 诱导目的蛋白表达. 经 Western blot 鉴定目的基因与(His)6 融合表达，将已表达的蛋白质通过 Ni2+NTA 亲和色谱柱进行纯化. 结果： PCR 得到结核分枝杆菌 furB，测序结果与Genbank 中报道的完全一致. SDSPAGE 显示，在 Mr 为 15.0103 处有相应的蛋白质表达条带，Western blot 鉴定为(His)6 融合表达蛋白. 经Ni2+NTA 亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白. 结论：
6、 成功克隆了铁调节蛋白基因 furB 序列，并在 E.coli DH5 高效表达，亲和层析后获得了纯化目的蛋白. 【关键词】 furB;表达;纯化;结核分枝杆菌 0 引言 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）在结核病(tuberculosis, TB)患者体内的生长与铁的利用有关. 研究发现，MTB 基因组包含了两个相似的铁摄取基因 furA 和 furB. furA 主要与其下游的katG 基因表达有关, 而 furB 的功能现在还不清楚为此，我们在原核表达载体中表达 MTB furB 并对其进行了纯化，为其功能研究奠定基础. 1 材料和方法 1.1
7、 材料 MTB 毒株 H37Rv, DH5 由本室保存; pGEMTEasy 及 Wizard Plus Purification system 购自 Promega 公司； Xgal, 限制性内切酶 BamH, Hind及 T4DNA 连接酶，TaqDNA 聚合酶均为 TaKaRa 公司产品；IPTG, DTT, DTE,小量质粒提取试剂盒均为 Sigma 公司产品，胶回收试剂盒为Vitagene 公司产品. 1.2 方法 1.2.1 引物的设计与合成根据已发表的 MTB H37Rv 全基因组 furB 编码区(2641648N,2642040C)序列设计引物. 上游引物 P1: 5GGAT
8、CCAGTGCAGCCGGTGTCCGC3中加入 BamH酶切位点；下游引物 P2: 5AAGCTTCCTTTTGGTGCTGGAGACGG3 中加入 Hind酶切位点. 引物由上海博亚生物技术有限公司合成. 1.2.2furB 片段的扩增取保存于改良罗氏培养基的 MTB H37Rv 接种于7H9 液体培养基，37间或振荡培养 23 wk. 取 5 mL 液体培养物的菌体沉淀重悬于 50 L 裂解液（10PCR 绶冲液 5 L, 45 g/L 吐温 5 L, 45 g/L NP40 5 L, 20 g/L 蛋白酶 K 0.5 L 及水 34.5 L）中. 于55水浴 1 h，沸水浴 10 mi
9、n 灭活蛋白酶 K，离心取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于 50 L TE 中1,作为 DNA 模板. PCR 反应体系为： 10buffer 5 L, dNTPs 5 L (2.5 mmoL/L)、DNA 模板为 1 L, P1, P2 引物各 1 L (25 moL/L)及 Taq 酶 1 L，加水至 50 L. PCR 条件: 94变性 40 s，56复性 30 s，72延伸 50 s, 25个循环. 1.2.3PCR 产物的克隆与鉴定 PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳回收 DNA 条带. 取纯化的 PCR 产物与质粒 pGEMTEasy 进行连接反应，转化感受态DH5, 均匀涂布于
10、含有 xgal(33 L) 和异丙基 D 硫代半乳糖苷IPTG(20 L)的 LB 培养皿中，37培养 16 h, 挑取白色菌落进行酶切鉴定，所获阳性克隆命名为 pGEMTEasyfurB，送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定. 1.2.4 目的蛋白的诱导表达经 BamH和 Hind双酶切后与经同样酶切的 pQE80L 载体进行连接反应， 转化感受态 DH5，挑取的阳性克隆命名为 pQE80LfurB. 在含有氨苄青霉素（100 mg/L）的 LB 培养基中过夜培养 pQE80LfurB. 按 10%的接种量进行转接，37摇菌 3 h，加入异丙基D 硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为 0.
11、5 mmoL/ L，37继续培养 45 h. 取 1.5 mL 细菌培养物，8000 g 离心 30 s 收集菌体，加入 2样品缓冲液剧烈振荡混匀，100, 5 min；8000 g 离心 5 min；取上清进行 SDSPAGE 电泳检测. 1.2.5 表达产物鉴定将经诱导的 pQE80LfurB 和 E.coli DH5 分别制样，进行 Western blot 分析. 1.2.6 表达蛋白的可溶性分析大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集细菌，超声破菌. 离心后将上清和沉淀分别制样，进行 SDSPAGE 分析. 1.2.7 表达产物的纯化根据 Ni2+NTA 试剂盒的说明书, 将融合蛋白与
12、Ni2+NTA 结合, 用不同 pH 值咪唑溶液进行洗脱, 得到纯化产物. 2 结果 2.1furB 片段的扩增及序列测定经 25 个循环 PCR 扩增，可得与预计长度相等的片断（Fig 1）. 将 DNA 回收后插入 pGEMTEasy 载体，经测序证实所扩增的 furB 序列与 Genbank 数据库所收录的 furB 序列完全一致. 2.2 表达载体的构建 pQE80L 经 BamH和 Hind双酶切后与 furB目的片断进行连接反应后，转化感受态 E.coli DH5. 挑取的克隆子进行酶切鉴定，切出约 561 bp 大小片段的为阳性克隆子(Fig 2 )，命名为pQE80L furB
13、. 2.3furB 在 pQE80L 表达载体中的诱导表达将 pQE80LfurB 经 37活化过夜，经 IPTG 诱导表达后做 SDSPAGE 分析，从电泳图中可以看出在 Mr为 15.0103 处出现了一条表达带，表达量约占菌体总蛋白的 20% (Fig 3). 2.4 目的蛋白的鉴定所构建的重组质粒表达的 FurB 蛋白以带有 6 个组氨酸的融合蛋白的形式出现，使用鼠抗 (His)6 mAb 验证 FurB 蛋白的表达. 结果显示在 Mr 为 15.0103 处有一显色带，而对照无相应条带 (Fig 4). 2.5 表达蛋白的可溶性分析将上清和沉淀分别所制样品，进行SDSPAGE 分析表
14、明表达产物主要在细菌裂解后的沉淀中，而上清中则很少(Fig 5). 2.6 目的蛋白的纯化纯化的产物经 SDSPAGE 分析可在 Mr 为15.0103 处得到一条清晰的条带(Fig 6). 3 讨论 由于 BCG 免疫效果极不稳定2 ，缺乏对 MTB 致病机制的深刻了解，现在全球已处于结核病的紧急状态3. 入侵机体的 MTB 和宿主的关系是动态的，必须快速适应不利并不断变化的环境. 金属离子的获取对病原菌的复制增殖是必需的. 铁是多种酶的辅因子，参与电子转运和氧化还原反应4 ，在 MTB 的生长过程中发挥了重要作用. 限制铁的利用可以延缓 MTB 的生长，同时铁的利用情况可作为反映几种毒性因
15、子表达水平的指标5. 相反，铁的无限制地摄取会导致铁中毒和氧化应激从而使细菌停止生长6. 病原菌的金属调控蛋白主要有四个不同的簇组成，分别为 Fur(ferric uptake regulator), DtxR(diphtheria toxin repressor), MerR 和 ArsR. MTB 基因组包含了两个相似的铁摄取基因furA 和 furB, furA 位于 katG 上游7 ，并与 katG 其表达调控有关, 而 furB 的功能还不清楚. 基因序列分析，MTB 基因组中的 furB 比 furA更相似于大肠杆菌 fur, 因此 furB 可能是细胞内多种基因表达的一个调控因
16、子. 本实验中应用的 pQE80L 表达载体为 4751 bp，起始码下游接有 6 个组氨酸，双链环状，Amp 抗性，多克隆位点有 9 个单一限制性酶切位点. PCR 产物共有 561 bp,其中 furB 本身有 393 个碱基，在其终止码的下游的 168 个碱基为非编码序列. 因此，furB 克隆入 pQE80L 载体中与 6 个组氨酸融合，可产生共 137 个氨基酸的融合蛋白，Mr 为 15.0103 左右，实验结果与理论值相符合. 融合蛋白有(His)6 的表达，因此通过检测组氨酸的表达，可间接证明 furB 表达，同时(His)6 的表达为进一步纯化蛋白提供了亲和位点，它可与 Ni2
17、+特异性结合，通过 Ni2+NTA 亲和色谱柱可得到纯化的目的蛋白. 我们成功地在原核表达系统中表达 MTB 的铁调控相关蛋白 FurB, 并进行了初步鉴定和纯化,为进一步研究 FurB 的功能奠定了基础. 【参考文献】 1 范雄林，徐志凯，李元，等. 结核分枝杆菌 Ag85B 成熟蛋白基因免疫J. 第四军医大学学报，2001;22(14):1283-1287. Fan XL, Xu ZK, Li Y, et al. Gene vaccination of Mycobacterium tuberculosis DNA vaccine encoding mature form of Ag85B
18、J. J Fourth Mil Med Univ, 2001;22(14):1283-1287. 2 江山，朱道银，蒋英，等. 结核分枝杆菌 Ag85BAg85A 双抗原融合真核表达质粒的构建及表达J. 第四军医大学学报，2003;24(21):19731975. Jiang S, Zhu DY, Jiang Y, et al. Construction of the fused eukaryotic expression vector of Mycobacterium tuberculosis Ag85B and Ag85A antigens and its expression J. J
19、Fourth Mil Med Univ, 2003;24(21):1973-1975. 3 Ulrichs T, Kaufmann SH. Mycobacterial persistence and immunity J. Front Biosci, 2002;7:458-469. 4 Earhart CF. Uptake and metabolism of iron and molybdenum A. In: Escherichia coli and salmonella: Cellular and molecular biology M. 2nd ed. Washington:ASM Pr
20、ess, 1996:1075-1090. 5 Litwin CM, Calderwood SB. Role of iron in regulation of virulence genes J. Clin Mecrobiol Rev, 1993;6:137-149. 6 Touati D. Iron and oxidative stress in bacteria J. Arch Biochem Biophys, 2000;373: 1-6. 7 Cole ST, Brosch R, Parkhill J, et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence J. Nature, 1998; 393: 537-544.
