1、金属硫蛋白 3 对快速老化痴呆模型小鼠海马 CA1 区神经元细胞凋亡的影响作者：马飞煜 王凤 王虎 田贤先 张昱 【摘要】 目的 研究金属硫蛋白 3(MT3)对快速老化痴呆模型小鼠(SAMP8)海马 CA1区神经元细胞凋亡的影响及其机制。方法 将 7月龄SAMP8小鼠随机分成 6组，分为痴呆组、3 种浓度的 MT3组、MT1 组、空白对照组。快速老化小鼠对照(SAMR1)小鼠为正常对照组。连续腹腔注射28 d后灌注取脑，进行海马 CA1区原位末端标记(Tunel)试剂盒和免疫组化(SP)试剂盒染色。结果 痴呆组海马 CA区神经元细胞凋亡指数明显高于正常对照组。高浓度 MT3组凋亡指数最低，Bc
2、l2 蛋白表达增强，Bax蛋白表达最低(P0.01，P0.05)。MT3 组对 Bax蛋白表达的抑制作用强于 MT1对照组，而二组对 Bcl2 蛋白表达的差异不显著。结论 SAMP8小鼠海马结构存在大量神经元细胞凋亡，MT3 通过减少 Bax表达和增加Bcl2 表达，减少细胞凋亡，并有浓度依赖关系；且作用强于 MT1。 【关键词】 MT3；SAMP8；细胞凋亡；Bax；Bcl2第一作者：马飞煜(1975) ，女，主治医师，博士，主要从事脑血管病及老年痴呆的研究。阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病，其特征性病理变化之一是脑内神经元数目的明显减少，尤其以海马结构受累最为严重。细胞凋亡是 AD
3、神经元丢失及其他病理学特征形成的主要原因。已有研究发现死后的 AD患者脑内存在大量凋亡神经元，并有凋亡信号分子凋亡促进基因(Bax)的高表达1 ，而在非痴呆老年人脑内几乎无表达。1991年，Uchida 等2首次从人脑组织中分离出金属硫蛋白 3(MT3)，因其只在脑内特异表达，可能具有重要的神经生理和神经调节功能。临床报道 AD患者脑内 MT3含量明显减少3 ，这就引发了许多 MT3与 AD发病机制的研究。快速老化痴呆模型小鼠(SAMP8)是日本 Takeda等人精心培育，具有快速老化痴呆的特征，平均寿命 12.1个月46 ，是目前公认的比较理想的自然衰老痴呆模型。SAMP8 小鼠的快速老化机
4、制是否与神经元细胞凋亡有关，以及 MT3对其海马结构细胞凋亡和相关蛋白表达影响的研究还未有报道。1 材料与方法1.1 主要实验试剂及仪器 原位末端标记(Tunel)试剂盒，兔抗鼠 Bas多克隆抗体，兔抗鼠凋亡抑制基因(Bcl2) 多克隆抗体，生物素化羊抗兔 IgG/Biotin，DAB 显色剂均由武汉博士德生物工程有限公司提供。MT3 及 MT1由北京大学生命科学院蛋白质工程实验室惠赠。Imagepro plus 图像分析系统(日本)。1.2 实验动物分组 选择雄性 SAMP8小鼠 60只，7 月龄，体重 2530 g，随机分成 6组：空白对照组(生理盐水)、低(1.5 mgkg-1d-1)、
5、中(3 mgkg-1d-1)、高(6 mgkg-1d-1)浓度 MT3组、MT1 对照组(3 mgkg-1d-1)和痴呆组。另将雄性 SAMR1小鼠 10只，7 月龄，体重 3040 g，为正常对照组。天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供。1.3 方法 连续 28 d腹腔注射给药，停药 1 d后将各组小鼠用 4%多聚甲醛灌注取脑，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明后，浸蜡，石蜡包埋制成蜡块，每只鼠海马连续发 45 m 片，备 Tunel和免疫组化(SP)法使用。1.3.1 Tunel 实验方法 石蜡切片脱蜡和脱水；用 4%多聚甲醛固定；100 l 新配制的蛋白酶 K工作溶液消化；再置于 4%多聚
6、甲醛溶液固定；加 100 l 平衡液缓冲，室温平衡 510 min；滴加 50 l TdT酶反应液；再加入 50 l 2SSC溶液终止反应；用 0.3%的 H2O2浸洗；滴加100 l 稀释的链酶亲和素 过氧化物酶(StreptavidinHRP) 溶液； DAB 显色剂加至标本片上；去离子水漂洗；梯度乙醇浸洗；二甲苯浸洗固定，树脂封片。阴性对照在操作步骤所用到的反应液中不添加 TdT酶，其余与实验组步骤相同。1.3.2 SP 分析 石蜡切片脱蜡和脱水；1% H2O2灭活内源性过氧化物酶；枸橼酸盐缓冲液修复抗原；正常山羊血清封闭非特异性抗原；滴加特异性一抗(兔抗鼠 Bas多克隆抗体或兔抗鼠 B
7、cl2 多克隆抗体)；生物素化羊抗兔(IgG/Biotin)；滴加 StreptavidinHRP 溶液；DAB 显色；苏木精复染，中性树脂封片。对照用聚丁二酸丁二醇酯 PBS代替一抗作阴性对照。1.4 图像分析及统计学分析 在光镜下进行观察，每张切片随机选取 20个高倍(400)视野，计数细胞，计算凋亡百分率，即凋亡指数(AI)，计算公式如下：AI(阳性细胞数/总细胞数)100%。数据以 xs表示，用 SPSS10.0统计软件，进行方差检验和 t检验。2 结果2.1 各组小鼠海马 CA1区神经元的 AI 正常对照组罕见凋亡细胞，AI 为(5.61.1)%；痴呆组海马CA1区可见大量凋亡细胞，
8、AI 分别为(38.83.1)%，与正常对照组相比，差异显著(P0.01)。低、中、高浓度 MT3组的小鼠海马 CA1区 AI依次为(23.43.6)%、(20.14.5)%、(15.73.9)%，高浓度 MT3组凋亡指数最低；与空白对照组 AI相比，差异显著(P0.05)。相同浓度 MT3和 MT1对照组小鼠海马 CA1的 AI分别为(20.14.5)、(21.63.8)，组间差异不显著。2.2 Bcl2 蛋白在各组小鼠海马 CA1区神经元中的表达Bcl2 蛋白在正常对照组组海马神经元中表达较强，IOD 值较高；而在痴呆组海马神经元中表达弱，IOD 值低，两组间差异显著(P0.05)。3 种
9、浓度 MT3组相比，Bcl2 蛋白在高浓度 MT3海马神经元中表达增强，但无统计学意义；分别与空白对照组比较，高浓度组 Bcl2 蛋白表达明显增强，IOD 值明显增高(P0.05)。Bcl2 蛋白在 MT3与 MT1两组间表达差异不显著。见表 1。2.3 Bax 蛋白在各组小鼠海马 CA1区神经元的表达 Bax 蛋白在正常对照组小鼠海马 CA1区神经元表达弱，IOD 值低；而在痴呆组小鼠海马神经元表达强，IOD 值高，两组间差异显著(P0.05)。高浓度 MT3组 IOD值是 3种浓度组最低，差异显著(P0.05)；分别与对照组相比高、中浓度 MT3组 Bax蛋白表达显著减弱，IOD 值明显降
10、低(P0.05)。Bax 蛋白表达在 MT3组明显低于 MT1组(P0.05)。表 1。表 1 各组小鼠海马免疫反应阳性神经元 IOD(略)3 讨论Smale等7研究发现，AD 患者脑内海马结构细胞凋亡明显增加，凋亡率要高出正常人 3050 倍，而正常脑内几乎没有或很少有细胞凋亡。采用 Tunel等凋亡检侧技术发现，AD 患者脑的易损区细胞凋亡明显增加，可见 DNA断裂损伤、凋亡小体及染色质凝集等8 。有关研究表明，AD脑内存在有多种凋亡病理因素，如氧化损伤、兴奋性毒性、能量代谢低下、凋亡相关基因表达、神经营养因子信息转导障碍等9，10 。Bcl2 家族是细胞凋亡机制中重要的调节因子，Bcl2
11、 、Bax 蛋白是这一家族中重要成员，对神经元的凋亡具有调控作用11 。Bcl2 是一种强有力的细胞凋亡抑制因子，在神经系统的发育过程，具有抑制细胞凋亡及类神经营养的作用12 。Bcl2 蛋白参与调控线粒体凋亡途径。而研究发现 Bax可能是 Bcl2 家族中最重要的凋亡促进因子13 。Bax 蛋白受到凋亡信号刺激后，可发生构型改变，形成同源二聚体，传递凋亡信号进入线粒体外膜14 ，在线粒体外膜形成孔道,消除线粒体膜电位，引起细胞色素 c释放，促进细胞凋亡。本实验 Tunel染色可见 8月龄 SAMP8小鼠海马 CA1区神经元细胞核着色及碎片状 DNA形成，即凋亡细胞，而正常对照组 SAMR1小
12、鼠海马很少有凋亡细胞。Bax 蛋白在 SAMP8小鼠海马神经元中高表达，启动了SAMP8小鼠的细胞凋亡机制，经过 MT3作用后表达明显减少，越高浓度MT3组 Bax蛋白表达越少，说明 MT3能够抑制 Bax蛋白的表达，降低细胞凋亡的发生，并有浓度依赖关系。而 Bcl2 蛋白在 SAMP8小鼠海马神经元中低表达，给予不同浓度 MT3后，高浓度 MT3组表达最多。说明 MT3通过增强 Bcl2 蛋白表达，同时减弱 Bax蛋白表达，减少 Tunel阳性细胞，抑制细胞凋亡，促进海马神经元存活及损伤修复。相同浓度 MT3与MT1组比较，Bax 蛋白表达 MT3组明显低于 MT1组，而对 Bcl2 蛋白表
13、达在二组之间差异无统计学意义。说明只存在于脑组织中的 MT3在抑制Bax蛋白表达发挥主要作用，而对 Bcl2 的影响 MT1与 MT3作用相差无几。AD中存在氧化应激损伤，氧化应激损伤可引起细胞凋亡15 。MT3引起 Bcl2 基因、Bax 基因表达改变的作用机制尚不完全清楚。可能与清除自由基、抗氧化物酶类活性增强导致的 Bax基因受抑制，Bcl2 被激活有关。而 Bcl2 的表达还能够诱导内源性抗氧化功能的增强，如超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱光甘肽过氧化物酶(GSHPx) 和过氧化氢酶等酶活性增高而阻止细胞进入凋亡过程。马飞煜等16的研究证实 8月龄 SAMP8小鼠海马组织存在氧化应激损伤
14、，MT3 能直接清除自由基，并使抗氧化物酶的活性增强。这可能与Bcl2 的表达能够诱导内源性抗氧化功能的增强而阻止细胞进入凋亡过程有关。MT3 清除自由基，增加抗氧化物酶类活性，也是抗细胞凋亡的原因之一。另外 MT3可以增加 SAMP8小鼠海马组织锌含量，从而增加抗氧化应激能力17 。锌可以保护性地抵御相关细胞因子介导的氧化压力敏感转录因素的活化、炎性细胞因子的上调和内皮细胞功能紊乱，从而起到制约细胞凋亡的作用。补锌抑制反应性氧化产物生成和增加抗氧化途径的活性，发挥抗氧化作用。【参考文献】1 Pompl PN,Yemul S,Xiang Z,et al.Caspase gene express
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