1、经颅重复性低频磁刺激后大鼠海马 FosB阳性标记的变化【关键词】 电磁场 关键词: 电磁场;海马;FosB;FosB;免疫组织化学 摘 要:目的 观察经颅重复性磁刺激（ rTMS）后海马 FosB 阳性标记的变化. 方法 SD 大鼠头部予以 1Hz，100mT 的磁刺激（美国 Magstim公司） ，每日一次，每次 10min，共 14d.最后一次刺激后 24h，灌注动物并取脑，经海马冠状切片，免疫组织化学 ABC 法检测海马各区 FosB 免疫阳性产物的表达. 结果 rTMS 后，大鼠海马齿状回及 CA1 区表现出明显增多及染色增强的 FosB 免疫阳性产物，CA2，CA3 区则未出现Fos
2、B 免疫阳性产物;假刺激组动物仅海马齿状回表现出少许淡染的FosB 免疫阳性产物，CA1，CA2，CA3 区则无 FosB 免疫阳性产物出现. 结论 我们认为 rTMS 后 FosB 免疫阳性产物在海马的集聚，提示 rTMS可能通过影响海马长时程神经和行为塑形而发挥其治疗作用. Keywords:electromagnetic fields;hippocampi;FosB;FosB;immunohistochemistry Abstract:AIM To observe the effects of repetitive transcra-nial magnetic stimulation（r
3、TMS）onFosB expressions in rat hippocampi.METHODS SD rats were treated with repetitive1Hz，100m Tesla transcranial magnetic stimula-tion for14d，10minutes each day and thenFosB expres-sions in hippocampi were detected immunohistochemically.RESULTS High and deeply stainedFosB expressions were induced in
4、 hippocampi of experimental rats，mainly located in the granule cell layer of dentate gyrus and pyramidal cell lay-er of CA1area.NoFosB immunoreactive nuclei were seen in CA2and CA3areas.In controlled animals，few and slight-ly stainedFosB positive neurons were found in the granule cell layer of denta
5、te gyrus，but noFosB expressions ap-peared in CA1，CA2and CA3areas.CONCLUSION FosB proteins could gradually accumulate in the hippocampi with repeated treatment of transcranial magnetic stimulation，which may play some important roles in treating neuropsy-chological diseases by mediating long-lasting n
6、eural and be-havioral plasticity. 0 引言 经颅磁刺激（TMS）已被广泛应用于神经系统运动通路功能的检查，近年来发现经颅重复性磁刺激（rTMS）能够替代电刺激方法来治疗抑郁症患者1，2 ，还明显改善与帕金森氏病相伴随的情感、认知及睡眠等障碍 3-5 ，但其对脑长时程影响的神经生物学基础尚不明了. Fos 基因家族转录因子如 c-fos，fosb，fosb（又称为 fosb2） ，fra-1 及 fra-2 等，在不同刺激作用于脑而引起的转录反应过程中发挥着重要的作用.实验表明，对慢性而非急性的刺激如应用可卡因、吗啡、尼古丁及抗抑郁和抗精神类药物6 ，或予以慢性
7、电刺激诱发惊厥（ECSs） 7 等，能引起 35 和 37ku Fos 样蛋白，又被称为慢性 Fos 相关性抗原（FRAs）在脑内的特定区域不同程度的表达，较之急性刺激后诱发的其他 Fos 样蛋白相对稳定且在脑内存留时间较长，如在慢性 ECS大鼠的纹状体及前额叶可存留至少 2wk，而这种慢性 Fos 相关性抗原被认为是慢性刺激下 FosB 的稳定性变异型8 . 本试验的目的在于观察 rTMS 对大鼠海马 FosB 蛋白表达的影响，以探讨 rTMS 治疗作用可能的机制. 1 材料和方法 1.1 动物 采用实验初始时体质量 200225g 的雄性 Spraque-Dawley 大鼠 16 只，随机
8、分为经颅重复性低频磁刺激组（n=10）和对照组（n=6）.动物饲养与实验均遵照本校实验动物饲养与使用规定. 1.2 经颅重复性低频磁刺激方法 将清醒实验动物置于长方形塑料器具中，头部暴露于一直径 8cm 的圆形磁刺激探头下，予以 1Hz，100mT的磁刺激（美国 Magstim 公司） ，每日一次，每次 10min，共 14d.对照组动物除不予磁刺激外，余处理方法同实验组动物. 1.3 组织固定与免疫组织化学步骤 最后一次刺激 24h 后，动物腹腔内注射戊巴比妥钠（40mg kg-1 ）麻醉并经左心室依次灌入生理盐水100mL，40g L-1 多聚甲醛液（溶于 pH7.4，0.1mol L-1
9、 的磷酸缓冲液）500mL（1.52h） ，立即取脑并浸入 200g L-1 蔗糖液中过夜（4）.冰冻切 30m 厚的纹状体冠状切片，每 4 张取一张，切片置于含有 0.01mol L-1 ，pH7.4 的磷酸盐缓冲液（KPBS）的小瓶中，用 ABC 法进行免疫组化染色:将切片浸入兔抗 FosB 血清（1 1000，Santa Creuz;稀释于含有 10g L-1 小牛血清白蛋白，2.5g L-1 Triton X-100 和 1g L-1 叠氮钠的 KPBS中）48h，随后依次进入生物素化抗兔 IgG（1 500，Sigma）和 ABC（1 500，Sigma）中室温下各孵育 2h，继之用
10、葡萄糖氧化酶-DAB-镍法将免疫产物显为黑色.未在孵育过程中省略了一抗的空白对照切片上发现免疫阳性标记的细胞.免疫组织化学染色后，将切片裱于明胶处理的载玻片上，梯度酒精脱水，二甲苯透明，D.P.X 树胶封片. 2 结果 2.1 动物行为 实验组动物在摄食、饮水、睡眠及体质量等方面与对照组动物未见有何差别，磁刺激后未引出惊厥等异常. 2.2 海马 FosB 的表达 经颅重复性磁刺激 14d 后，大鼠的海马齿状回（DG）及 CA1 区出现密集分布的染色较深的核性 FosB 免疫阳性标记物，而 CA2 及 CA3 区则未见到免疫阳性标记物的出现（Fig1）.其中海马 CA1 区的阳性标记密集于锥体细
11、胞层（pcl） ，多型细胞层（so） 、透明层（sl）和放射层（sr）则无免疫阳性细胞（Fig3）;齿状回的免疫阳性标记物主要集中于颗粒细胞层（GL） ，而分子层（ML）和多型细胞层（PoDG）没有出现阳性的免疫标记物（Fig5，7）.假刺激组动物，仅在海马齿状回上发现少许染色较刺激组浅的阳性反应物，仍集中于颗粒细胞层（Fig6，8） ，其他各层及 CA1，CA2，CA3 区各层则未见免疫阳性标记出现（Fig2，4）. 3 讨论 近年来，rTMS 显示出在情感障碍性精神疾患等上的治疗作用，使人们对 rTMS 如何影响脑结构和功能产生了越来越大的兴趣.神经生物学研究发现，予以重复性磁刺激后，前额
12、叶 -肾上腺能受体明显上调，纹状体 -肾上腺能受体下调，海马的受体水平未出现变化9 ;海马突触传递，特别是五羟色胺及去甲肾上腺素对突触活性的调节作用的研究发现，经颅重复性磁刺激能长时程的降低中枢调控系统的效率10 .FosB 含有 237aa，FosB 则为 338aa.FosB 能被抗 FosB N 末端（79131aa）而非抗 FosB C 末端（245315aa）抗体识别，而 FosB 能被两者识别，本文中所应用的为抗 75150aa 片段的抗 FosB 抗体，因此能够识别 FosB. 本实验结果发现，经颅重复性磁刺激后海马齿状回及 CA1 区FosB 表达增加，提示这种重复性刺激能引起
13、 FosB 蛋白在海马的集聚. 早些时候的工作显示 FosB 和 FosB 的稳定性相似，急性 ECS 或可卡因刺激后数小时恢复到正常水平，而反复性刺激能降低 FosB 和 FosB两种 mR-NA 的生成能力11 .这与慢性刺激后慢性 FRAs 的逐渐集聚相矛盾.一种可能的解释是慢性 FRAs 一经产生，就是相对稳定的蛋白.新近分子生物学试验表明8 ，FosB 蛋白较 FosB 蛋白更稳定，而且具有负性调节 FRA-2 蛋白表达等功能.FosB 转染细胞表达很高水平的33，35，37ku 等 FRAs.33kuFosB 蛋白与 FosB 衍生蛋白一样，半衰期相对较短，仅 910h，这与急性
14、ECS 或可卡因刺激后这些蛋白瞬间大量的表达相一致.35，37kuFosB 蛋白则具有较长的半衰期，其中 35ku 蛋白可达 28h，37kuFosB 蛋白更可长达 208h，实验还表明 35，37kuFosB蛋白与慢性刺激后脑内出现的慢性 FRAs 一致.本实验在最后一次经颅磁刺激后 24h 处死动物，因此磁刺激本身或处死动物过程中的麻醉等所引起的瞬时 33kuFosB 和 FosB 表达已近消失，我们观察到的齿状回及 CA1区 FosB 表达增加，我们认为更主要的为 35，37kuFosB 蛋白. Chen 等8 认为 fosB 基因是一种非典型的即刻早期基因，在单一急性刺激时产生不稳定的
15、蛋白质产物，重复性刺激时则产生稳定的蛋白质.这种稳定性蛋白质可能从两个方向发挥其功能作用，一方面表现出与不稳定蛋白质一样的翻译效应，对重复性刺激做出反应时能够为细胞节省能量，另一方面则表现出与不稳定蛋白质相反的翻译效应，在对重复性刺激做出反应时起着负性反馈作用.FosB 还具有 AP-1DNA 结合活性并能调节含有 AP-1 位点基因的启动子的活性.在敲除 fosB 基因小鼠观察到慢性 ECS 和可卡因刺激后行为出现异常12 ，也提示 FosB 蛋白具有重要的功能. 本研究的结果表明，rTMS 能引起 FosB 蛋白在海马的集聚，而重复性刺激后 FosB 蛋白的逐渐集聚可能通过影响长时程的神经
16、和行为塑形来发挥作用. 图 1 图 8 略 参考文献: 1Triggs WJ， McCoy KJ，Greer R，Rossi F，Brower D，Ko-rtenkamp S，Nadeau SE，Heilman Km，Goodman WK.Effects of left frontal transcranial magnetic stimulation on depressed mood，cognition，and corticomotor threshold J.Biol Psychi-atry，1999;45（11）:1440-1446. 2Menkes DL，Bodnar P，Balle
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