1、静脉曲张过程中血管内皮细胞 NO 合成酶表达变化【摘要】 目的 探讨下肢静脉曲张过程中管壁血管内皮的变化及一氧化氮（NO）合成酶的改变与静脉曲张发生的关系。方法 选用 17例曲张大隐静脉的内皮细胞作为观察组，选择 3例正常静脉的内皮细胞作为对照组，应用苏木精 伊红染色观察内皮的一般形态学变化，采用免疫组织化学染色观察内皮细胞 NO合成酶的表达情况。结果 正常静脉管壁厚度均匀一致，内弹力膜完整紧密，无断裂，内皮细胞分布均匀；而曲张静脉的管壁厚度不一，内膜不完整，内皮细胞大部分脱落。与正常静脉相比，代偿期曲张静脉内皮细胞 NO合成酶表达增高（F=260.83,q=4.96，P0.05） ，而失代偿
2、期曲张静脉内皮细胞 NO合成酶的表达则明显降低（q=11.83，P0.05） 。结论 曲张静脉内皮组织损伤随病变进程逐渐加剧；曲张静脉内皮细胞 NO合成酶的表达从最初的增高到逐渐减低，可作为曲张静脉由代偿到失代偿的标志。 【关键词】 静脉曲张 内皮细胞 一氧化氮合酶 ABSTRACTObjectiveTo study morphological changes and nitric oxide synthetase (NOS) expression in endothelial cells of patients with varicose veins.MethodsSeventeen pat
3、ients with varicose veins and three healthy adults were included in the study. HE staining used to display the morphology of vascular endothelium. Immunohistochemical method was applied to study the expression of NOS in the vascular endothelium.ResultsVeins from the healthy adults were uniform in th
4、ickness, and with intact internal elastic membrane. While veins from the patients were diverse in thickness, and the internal elastic membrane was not intact. Compared with that of the vein from healthy adults, NOS expression in the varicose veins increased in the compensatory period but decreased i
5、n the decompensatory (P0.05).ConclusionThe damage of varicosevein vascular endothelium gradually aggravates with the progress of the disease, the expression of NOS from its elevation in the beginning to decline can be regarded as an symbol indicating the disease from compensation to decompensation.
6、KEY WORDSvaricose veins; endothelial cells; nitric oxide synthase 下肢静脉曲张是慢性下肢血管功能不全最常见的临床表现之一。其主要表现为下肢静脉迂曲扩张，影响外观，可伴有疼痛、麻木等感觉及运动障碍，重者可伴有下肢色素沉着甚至皮肤溃疡形成，给病人的身心健康造成了极大的损害。有研究认为，静脉曲张是静脉壁适应各种病理状态所引发的、以血管壁细胞和细胞外基质（ECM）等有形成分变化为主的代偿反应的结果1，2。早在 1980年，FURCHGOTT 等就证实，当血液对血管壁的切应力增大时，内皮细胞可通过合成分泌内皮舒张因子，令血管平滑肌舒张，以
7、使血压不致过高。近年来研究表明，这种内皮舒张因子即一氧化氮（NO）3。本实验旨在通过对下肢静脉曲张管壁血管内皮的变化以及 NO合成酶活性的研究，探讨血管内皮结构变化及 NO合成酶的改变与静脉曲张发生的关系。 1 材料与方法 1.1 材料 采集大隐静脉 20例，其中正常大隐静脉 3例（男 2例，女 1例） ，曲张大隐静脉 17例（男 12例，女 5例） 。兔抗人 NO合成酶抗体和即用型 SABC免疫组化染色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。 1.2 方法 1.2.1 大隐静脉取材 术中结扎大隐静脉近端 5条分支，距入股静脉 0.5 cm处切断近端。向远端游离大隐静脉主干约 2 cm，于剥脱
8、器插入前切取迅速用生理盐水冲洗，置入 40 g/L多聚甲醛溶液内固定。距内踝上方 78 cm处切开曲张成团大隐静脉表面皮肤，分离切取静脉长度约12 cm，40 g/L多聚甲醛固定。取近端、远端管壁，置 4 冰箱内保存待行切片染色。 1.2.2 切片准备 取出标本修理平整，流水冲洗 30 min，置 40 g/L多聚甲醛后固定 2 h，蒸馏水浸泡 4 h。常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，连续切片，片厚 7 m，粘于多聚赖氨酸处理后的玻片上备用。 1.2.3 免疫组织化学检测 H2O2切片经常规脱蜡、水化至水，以体积分数 0.03甲醛溶液室温下阻滞内源性过氧化物酶活性。PBS 液冲洗 3
9、次，每次 10 min；经体积分数 0.05马血清孵育 10 min。兔抗人 NO合成酶(1800) 40 下孵育过夜，PBS 冲洗 3次，每次 10 min；在室温下用生物素标记的二抗孵育 1 h，PBS 冲洗 3次，每次 10 min；滴加试剂SABC室温 30 min，PBS 冲洗 3次，每次 10 min；DAB 显色后常规脱水，透明，封片，显微镜下观察。 1.2.4 统计学处理 光学显微镜下每一视野电脑自动识别提取至少50个阳性细胞，同一水平管壁与瓣膜因其面积过小则另选取视野直至阳性细胞数达 50个，分别计算阳性细胞在单位视野的平均面积，以s 表示，各组间比较采用随机分组方差分析。
10、2 结 果 2.1 光镜观察 2.1.1 正常静脉管壁组织结构 正常静脉的管壁厚度总体来看均匀一致，管壁各结构苏木精染色分布均匀。近端管壁较薄，瓣膜多见，内膜薄，与中膜分界不清，光滑细致，内皮细胞连接紧密延续，细胞形态以扁平为主，细胞核呈黑色，扁平清晰，内弹力膜完整紧密，无断裂；瓣膜由两层内皮细胞夹以胶原纤维、弹力纤维构成，三者分布特征与同一水平管壁相同，于瓣膜基底与管壁相连处可见少量平滑肌细胞向瓣膜内延伸。 2.1.2 曲张静脉管壁组织结构 代偿期静脉管壁组织结构：此期曲张静脉的整个管壁厚度不一，这一差异主要是由平滑肌细胞的数量不同引起。内膜粗糙断裂，弹力膜不完整，内皮细胞部分脱落，残存细胞
11、变圆，分布散在，连接疏松，内膜与中膜分界模糊；瓣膜内皮细胞亦部分脱落，其内胶原增多而弹力纤维减少。失代偿期静脉管壁组织结构：此期曲张静脉的管壁厚度差异进一步加大，可见一侧管壁极度增厚而对侧管壁极度变薄，其差异主要成分为平滑肌细胞与胶原纤维。内膜更加不完整，甚至消失，内皮细胞大部分脱落，弹力膜断裂直至消失；瓣膜内皮细胞变化同管壁，胶原纤维数量更多，弹力纤维进一步减少。 2.2 免疫组织化学染色 2.2.1 正常静脉 正常静脉内皮细胞免疫组化染色可见内膜上细小颗粒均匀分布，密度相近，大小相似。近管腔一侧的瓣膜内皮上亦可见细小均匀分布的颗粒整齐排列，密度与管壁一致；近管壁一侧的瓣膜内皮上颗粒密度减低
12、，变细变小，分布不均，与其相对应的管壁内皮上亦可见相似变化。 2.2.2 曲张静脉 代偿期曲张静脉：代偿期曲张静脉内皮细胞 NO合成酶的阳性颗粒数量增加，大小变大，密度加深，瓣膜阳性颗粒亦有相同变化，二者的变化程度一致，且瓣膜近管腔侧阳性颗粒明显多于近管壁侧。失代偿期曲张静脉：此期曲张静脉大部分内皮细胞脱落消失，残留内皮细胞 NO合成酶阳性颗粒变小变细，密度更低，甚至消失，相同变化亦出现在同一水平的瓣膜上。 2.2.3 NO合成酶阳性细胞平均面积比较 正常静脉及代偿期、失代偿期曲张静脉 NO合成酶阳性细胞平均面积分别为（754.45102.38） 、（1 015.33305.99） 、 （39
13、3.2310.04）mm2，与正常静脉相比，代偿期曲张静脉内皮细胞 NO合成酶的表达增高（F=260.83,q=4.96，P0.05） ，而失代偿期曲张静脉内皮细胞 NO合成酶的表达则明显降低(q=11.83，P0.05） 。 3 讨 论 下肢静脉曲张是血管外科常见的疾病之一。迄今为止，静脉曲张的病因仍不十分明确，众多学者意见不一，有关其病因及发生发展过程，目前有各种各样的假说：静脉瓣膜学说、静脉管壁学说、动静脉交通学说、深静脉瓣膜功能不良学说以及管壁重塑学说4,6。管壁重塑学说是近几年刚刚兴起的一个比较热点的学说，该理论认为静脉曲张发生的主要原因是在静脉高压与血液淤滞、管壁低氧等始动因素的诱
14、导下，内皮细胞受损，进而引发一系列级联反应，最终导致静脉管壁薄弱扩张6。 正常静脉管壁的组织结构分内膜、中膜和外膜三层7。本实验中观察到正常静脉的管壁厚度均匀一致，内弹力膜完整紧密，无断裂，中膜内平滑肌细胞、胶原纤维、弹力纤维三种成分分布均匀；而曲张静脉的管壁厚度不一，内膜不完整，内皮细胞大部分脱落，中膜内平滑肌细胞大量聚集成团，弹力纤维成分减少，胶原纤维增多，这种变化随曲张静脉由代偿到失代偿逐渐加剧。这一结果说明静脉内皮细胞在曲张重塑过程中存在着由正常到代偿再到失代偿的功能变化，这一功能变化是与静脉曲张发展过程中腔内压力变化密切相关的。 NO是体内 NO合成酶催化 L 精氨酸氧化生成的一种具
15、有多种生物学效应的特殊递质，通过和细胞内的酶作用形成 OH-，以直接损伤等方式发挥其影响。血管内皮细胞 NO合成酶的表达可看作 NO变化的指标，本实验观察到正常静脉管壁的内皮细胞分布整齐光滑，NO 合成酶的功能处于正常水平；随静脉曲张的发生，内皮细胞表面粗糙、部分脱落，残存内皮细胞 NO合成酶的阳性颗粒较正常静脉增多，密度加大，我们认为此时期的静脉管壁因自身调节功能来代偿而未导致管壁囊性扩张；随病变的进展，内皮大部分脱落甚至消失，其残存内皮细胞 NO合成酶阳性颗粒较正常静脉明显减少，密度降低，此时期的静脉管壁不能通过自身调节功能来代偿而导致管壁囊性扩张。这一结果说明静脉内皮细胞在曲张重塑过程中
16、存在着由正常到代偿再到失代偿的功能变化，这一功能变化是与静脉曲张发展过程中腔内压力变化密切相关的，即早期主要是为了降低管腔内日益增高的压力，随着病变的发展，内皮细胞的脱落及其功能的逐渐衰竭，内皮细胞 NO合成酶的表达也由代偿发展至失代偿，合成逐渐减少，也就是说此时静脉管壁腔内逐渐升高的压力已不能单纯由平滑肌的舒张来缓解，而是由代偿期的各结构功能代偿演变为各结构的重塑过程。 综上所述，曲张静脉的发展过程中内皮细胞 NO合成酶活性的改变，即从最初的增高到逐渐降低，说明内皮细胞在功能上存在着由代偿到失代偿的循序渐进的发展过程。能否通过调控内皮细胞 NO合成酶活性的改变治疗静脉曲张有待研究。 【参考文
17、献】 1GIBBONS G H, DZAU V J, RENOULE G, et al. The emerging concept of vascular remodelingJ. N Engl J Med, 1994,330(20):1431. 2JACOB M P, BADIERCOMMANDER C, FONTAINE V, et al. Matrix remodeling in the vascular wallJ. Pathol Biol Extracellular (Paris) 2001,49(4):326332. 3MICHIELS C, ARNOULD T, REMACLE
18、J, et al. Hypoxiainduced activation of endothelial cells as a possible cause of venous diseases: hypothesisJ. Angiolohy, 1993,44(8):639. 4ZUKOWSKI A J, NICOLAIDES A N, SZENDRO G, et al. Haemodynamic significance of incompetint calf perforating veinsJ. Br J Surg, 1991,78(5):625. 5ROSE S S, AHMED A, N
19、IELS E P, et al. Some thoughts on the aetiology of varicose veinsJ. J Cardiovasc Surg, 1987,27(5):534. 6MICHIELS C, ARNOULD T, REMACLE J, et al. Endothelial cell responses to hypoxia: initiation of a cascade of cellular interactions J. Biochin Biophys Acta, 2000,1497:110. 2王豪夫,邱法波,张建立,等. 下肢深静脉造影术的临床评价J. 青岛大学医学院学报, 1996,32(4):332334.
