1、抗 HBs mAb 的研制及其对野生与免疫逃逸变异 HBsAg 的交叉反应特征作者：李方和, 张小燕, 严兵, 张波, 黄永国, 张春燕, 龚劲松, 陈妍, 刘静华【摘要】 目的: 抗 HBs G6 mAb 制备及其对重组野生与免疫逃逸变异 HBsAg 结合能力与特点的评价。方法: 常规制备并纯化抗 HBs mAb, 以纯化抗 HBs mAb IgG 包被, 采用 ELISA 对 17 种野生及“a”决定簇替代性变异全基因重组表达 HBsAg 进行检测, 并与几种市售 HBsAg 检测试剂进行比较。结果: 该杂交瘤细胞生长与分泌特性稳定, 其培养上清与腹水效价分别为 2048 及 409610
2、3; 对野生 HBsAg 检测（ELISA）敏感性不低于 0.125 g/L。该抗体可与 15 种变异抗原中 12 种发生反应（P/N2.5）, 反应信号强度分别为低反应组（2 份, 与野生株 A 值比较, 下同）平均 7.55%; 中反应组（1 例）为 59.40%; 高反应组（9 种）分别为野生株的 92.1%109.4%, 低反应或无反应表达产物的免疫逃逸变异部位集中在 HBV“a”决定簇 I 环的起始部即 120124 序列之间。部分表达产物采用市售试剂作同步检测, 平均显色强度高于或明显高于几种国内应用最为普遍的 HBsAg ELISA（P0.05 )。结论 : 抗 HBs G6 m
3、Ab 对多数免疫逃逸变异 HBsAg 有很强的结合能力, 所针对的变异类型亦表现出某种特殊的规律。 【关键词】 乙型肝炎病毒 基因变异 HBsAg 免疫逃逸 ELISAAbstract AIM: To prepare monoclonal antibodies against HBsAg and estimate its binding capacity to both wildtype and varies of immune escape mutanttype HBsAg. METHODS: Using selfmade the antiHBs G6 mAb and HRPlabeled
4、goat antiHBs antibody, A sandwich ELISA for detection both wildtype and varies of immune escape mutanttype HBsAg has been developed. Applying this assay, to detect 17 species of whole gene wildtype and recombination expressed HBsAg which varied in “a” determinant. to evaluate its clinical applicatio
5、n characteristic of this assay, we used the other commercial reagents to Comparing with it. RESULTS: One strain hybridoma cell lin secreted antiHBs mAb (defined G6), was obtained. It grew stably and the titers of the culture supernatant and hydroperitoneum were 2 048 and 4 096103. The sensitivity to
6、 the wildtype HBsAg of this assay was less than 0.125 g/L. This antiHBs mAb can bind with 12 in 15 species mutant HBsAg (P/N2.5), and 2 of them were low absorbent value at 450 nm(A450) group which was 7.55 percent of the wildtype, 1 of them was middle A450 value group which was 59.40 percent of the
7、wildtype, 9 of them were high A450 value group which was 92.1-109.4 percent of the wildtype. The low A450 value group and the negative group were diversified in 120-124 basyl in I loop of the HBV “a” determinant. We also used other commercial reagents, which was widely used in clinic, to detect part
8、ial species mutant HBsAg, the average A450 value was less than foregoing assay. CONCLUSION: The G6 antiHBs mAb was able to bind most of the immune escape mutant HBsAg in the test. And there would be some special regulations between the mutant site and the recombination expressed HBsAg binding capabi
9、lity.KeywordsHBV; gene variation; HBsAg; immune escape; ELISA乙型肝炎病毒感染流行范围广, 感染人数多, 是目前全球最为严重的公共卫生问题之一。该病毒的 DNA 多聚酶缺乏校对功能, 较其他病毒更易形成遗传变异, 一旦变异发生在某些特定基因区段（如 S 基因“a”决定簇）, 即可引起所表达蛋白（HBsAg）的抗原性发生漂移或明显漂移, 从而形成 HBV 免疫逃逸变异株（hepatitis B virus immune escape mutant strain, HBV IEMS） 。由于这类变异病毒在体内不能为针对野生 HBV 的保护
10、性免疫中和, 在体外其 HBsAg 不能为多数现行市售试剂所检出, 其存在势必造成部分 HBV 感染者临床诊断困惑, 献血员筛查漏检, 及其血清流行病学调查失真, 已受到国内外学者的广泛关注2, 3。作者所在单位自上世纪末即高度关注这一现象, 并为此进行大量的研究。新近又获得一株能与多数免疫逃逸变异（IEM）HBsAg 有极强结合能力的单克隆抗体（细胞克隆序号 G6B3F1, 分泌物简称抗 HBs G6 mAb）, 并对其与 HBV“a”决定簇变异重组表达产物的结合特征进行了初步的评价。1 材料和方法1.1 材料 BALB/c 小鼠由湖北省疾病预防控制中心动物室提供; HBV Dane 颗粒、
11、 全基因重组野生 HBsAg 及 Al(OH)3 凝胶由卫生部武汉生物制品研究所提供; Sp2/0 细胞由中国典型培养物保藏中心提供; RPMI1640 培养基购自 Gibco 公司; PEG、 HAT、 HT 以及鼠免疫球蛋白亚类检测试剂等购自 Sigma 公司; 羊抗鼠 IgG 及 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 购自美国 Pierce 公司; HRP 标记羊抗 HBs、 部分 HBsAg ELISA 试剂盒自市售获得; 抗 HBs A11 mAb 与抗 HBs Mt mAb 由中科院武汉病毒研究所提供; 乙肝病毒 G145R 变异表面抗原由本室既往制备; 其他多种野生与 IEM 重组全基因
12、 S 蛋白表达产物（表 1）由本院临床免疫研究室收集并提供。1.2 方法1.2.1 抗 HBs G6 mAb 的制备 按文献报道4。常规免疫小鼠, 融合及有限稀释法制备杂交瘤细胞; 降植烷诱导法制备腹水; 采用紫外比色（以 BSA 为标准）测定腹水中总蛋白含量。抗 HBs G6 mAb IgG 的纯化采用辛酸 硫酸铵沉淀法。1.2.2 G6ELISA 的建立 采用纯化抗 HBs G6mAb IgG 包被, 羊抗 HBsHRP 示踪, 建立双抗体夹心 ELISA。主要操作为(1)将抗 HBs G6mAb IgG 以 pH9.6 的碳酸缓冲液稀释 , 加入酶标反应板各孔中 , 4放置过夜; （2）
13、以 PBST 洗涤 5 次, 加入 20 g/L BSA（150 L/孔）, 置37 2 h, 甩干; （3）加入待测或对照标本（100 L/孔）, 37反应30 min; （4）同上洗板, 每孔加入 100 L 羊抗 HBsHRP, 37反应30 min; （5）同上洗板, 加入 TMBH2O 溶液显色 15 min, 以 2 mol/L H2SO4 终止反应, 置酶标仪上测定 A450 值, 以 P/N2.1 判为阳性。1.2.3 阻断试验 在上述 G6mELISA 的基础上进行, 主要操作为 MT mAb 或 A11 mAb 包被; 包被; 加入与不同抗 HBs G6 mAb IgG 预
14、温（30 min）后的 rwHBsAg 或 rG145R HBsAg 反应; 加入 HRP 标记羊抗HBs 反应; 加入 TMBH2O 溶液显色, 同上测定 A450 值, 并与未中和孔比较计算实验孔显色抑制百分率。1.2.4 常规 HBsAg ELISA 检测 其他多种 HBsAg ELISA 检测参照试剂说明进行。1.2.5 统计学处理 采用 SPSS13.0 统计软件进行数据统计分析, 结果以 P0.05 为有统计学意义。2 结果2.1 mAb 的制备 采用常规细胞融合制备杂交瘤细胞 , 以间接ELISA 对其抗体的特异性与分泌能力进行筛选, 经 3 次克隆化（有限稀释法）后获得能高效分
15、泌抗 HBs IgG6 mAb 的 G6B3F1 杂交瘤细胞系。以降植烷诱导法制备腹水, 并以辛酸 硫酸铵沉淀法纯化, 产物即为抗 HBs G6 mAb IgG。采用紫外比色及其双抗体夹心 ELISA 对细胞培养上清、 腹水及纯化产物进行检测, 杂交瘤上清抗 HBs 效价为 2048, 后二者蛋白含量及效价分别为 11.23.16 g/L 与 4096103, 以及 3.6 g/L 与 1 024103。2.2 G6M ELISA 的敏感性 采用 G6ELISA 对系列稀释的部颁高浓度 HBsAg 值控血清进行检测, 并与重组 G145R 变异全基因表达产物（浓缩培养上清）进行比较, 实验结果
16、见图 1。该抗体与 2 种不同抗原反应的显色强度大致相当, 稀释曲线斜率分别为 0.716 与 0.729; 部颁质控血清（自然表达野生 HBsAg）稀释至 0.125 g/L 时仍能得到较强阳性结果（P/N 值为 4.5） 。图 1 野生与 G145R 变异 HBsAg 在 G6 ELISA 检测中的反应性比较（略）Fig 1 The comparision of the reactivity between wHBsAg and G145R mutant HBsAg in the G6 ELISA2.3 变异抗原结合特征 采用同上 G6mELISA 对 15 份全基因重组“a”决定簇变异表
17、达产物进行检测, 并与野生及非“a”决定簇变异表达产物进行比较, 实验结果（表 1） 。表 1 抗 HBs G6 mAb 对“a”决定簇变异重组全基因 HBsAg 的反应特性（略）Tab 1 The reactivity of antiHBs G6 mAb to recombinational whole gene HBsAg which varied in “a” determinant*: Take the average A450 of Gly Dr and Gly Dw as 100%; *: The A450 of nontransfection supernatant contro
18、l was 0.06.G6mAb 能与 15 种参与研究的 IEM HBsAg 中的 12 种发生反应, 对其中 9 种 IEM HBsAg 在 ELISA 中的显色信号超过 rwHBsAG 产物的90%。(2)以羊抗 HBs HRP 取代各自示踪抗体, 采用 5 种不同市售试剂对12 种基因重组“a”决定簇变异表达产物进行检测, 以重组野生全基因表达产物（2 种）的同期检测信号为基数计算各表达产物的平均显色率（%）, 并与 G6mELISA 进行比较。实验结果(表 2)。表 2 不同 ELISA 对部分重组免疫逃逸变异 HBsAg 检测能力的比较（略）Tab 2 The comparisio
19、n of the detection capability to partial recombination immune escape mutant HBsAg*: Reaction intensity rank: high80%; Middle 30%80%; Low30%; *: Compared with G6mELISA; #: Coated with multiclone antibody.2.4 抗 HBs G6 mAb 抗原结合位点分析 采用不同纯化抗 HBs MT与 A11 mAb 分别包被反应板, 以纯化抗 HBs G6 mAb 为阻断抗体, 通过双抗体夹心 ELISA 阻
20、断试验分析抗 HBs G6 mAb 与其他抗 HBs mAb 在抗原结合位点上的差别, 实验结果（表 3）显示抗 HBs G6 mAb 能同时阻断 MT mAb 跟 rwHBsAg 与 rG145RHBsAg 2 种抗原的反应; 其有效阻断（即产生50%以上阻断率）浓度前者几乎较后者低一个数量级。A11 与 rwHBsAg的反应可为高浓度抗 HBs G6 mAb 阻断, 其与 rG145R HBsAg 的反应未显示出明确的检测信号。同上反应条件下, 对抗 HBs A11 mAb 与抗 HBs MT mAb 二者相互做中和试验。在饱和包被, 以野生 HBsAg 为抗原, 中和抗体分别为 100
21、mg/L 浓度下, 二者平均阻断率仅为 6.83%及 1.45%。表 3 抗 HBs G6 mAb 抗原结合表位的初步分析（略）Tab 3 The initial analysis to antigen binding epitope of the antiHBs G6 mAb*: Interrupted hole A value/interruption rate; *: Anti HBs A11 mAb cannot react to rG145R HBsAg under this coating concentration, interruption test cannot be eff
22、ective.上述结果表明抗 HBs G6 mAb, A11 mAb 及 MT mAb 所针对的均为HBsAg 上独立的抗原决定簇; 前二者所对应抗原决定簇在 rwHBsAg 分子的距离（包括结构与空间距离）较大但仍有一定的相关性; 抗 HBs G6 mAb 能较好阻断抗 HBs MT mAb 对野生与 G145R HBsAg 的结合, 但其阻断能力存在明显差别, 提示它们所针对抗原决定簇的空间距离较其与抗 HBs A11 mAb 显然要近。该实验显示抗 HBs G6 mAb 对 2 种抗原在结合能力上的差别, 推测为 G145R 变异所致变异蛋白空间结构改变所带来的影响。3 讨论和野生 HB
23、V 一样, HBV IEMS 感染临床诊断与流行病学的研究亦应包括对基因、 抗原及抗体等不同层面标志的检测。这些标志检测的方法、 阳性率及其阳性覆盖面各异, 临床意义亦各不相同。国内外对血清 IEM HBsAg 临床漏检的认识与研究起源于上世纪 90 年代初, 重新启用多克隆抗 HBs, 采用抗 HBsAg 非“a”决定簇区段的高亲和力抗体, 以及研制一组针对不同 IEMHBsAg“a” 决定簇的 mAb 作包被抗体, 所研发的标记免疫学试剂虽不能确证单个 HBV IEM 感染的临床诊断, 但能明显提高 HBV IEM 感染的临床检出率, 并进而最大限度防止因感染者漏检而引发的公共卫生问题。我
24、国自 2000 年以来部分国产 ELISA 试剂在一定程度上具备了对 IEM HBsAg 的检测能力, 但迄今仍未能开发出检测效果与雅培化学发光类似的诊断产品。作者长期从事 mAb 制备与传染病的临床诊断研究, 经较长时期努力成功地制备出抗 HBs G6 mAb 杂交瘤细胞株。系统的鉴定结果显示该细胞株具有较高的抗体分泌能力, 其分泌产物的特异性、 强硬度及其与靶物质的免疫亲和力与当前市售 ELISA 试剂所采用的抗体相当或更优（部分资料未显示）, 以此建立的 G6 ELISA 对野生 HBsAg 检测的敏感性高于 0.125 g/L。进一步分析显示该抗体对 IEM rHBsAg 的结合具有以
25、下特点。 （1）对IEM rHBsAg 检测的覆盖面较既往多数报道明显为宽（12/15）, 其反应强度呈现一种非高即低的鲜明特点, 对 IEM rHBsAg 的检测能力明显优于多数现行市售试剂5; （2）对“a”决定簇 II 环的 139、 145、 144、 143、 142 等位点替代性突变质粒表达产物的结合能力与重组野生 HBV S抗原大致相当, 对“a”决定簇 I 环起始部及其附近如 120、 122、 123、 124 等位点替代性突变质粒表达产物的结合能力明显降低; （3）对“a”决定簇 I 环内 126 位点突变产物的结合能力与野生株相当, 对129 位点突变表达产物的结合视取代
26、氨基酸不同而存在较大差别; （4）与多点突变质粒表达产物的结合未表现出明显的倾向性, 但“a”决定簇II 环中后部的变异似乎可在一定程度上纠正因 I 环起始部变异造成的反应性低下。突变部位在亲水区“a”决定簇以外 IEM 产物与该抗体的结合与野生株雷同。有关 IEM 产物结构与抗原性漂移程度之间的关系已引起国内外学者较多关注, 但其研究结果尚不足以阐述其间的内在规律。国内何建文、 刘芳等在对 129H 及 129L 的研究中发现原始与替代氨基酸之间亲水性差异的大小是导致 IEM 变异产物对原有（即针对野生株）抗体结合力下降的主要原因6。 Hou 等发现 2 例 aa121124 位之间插入性突
27、变的 IEM HBV 感染者, 其 IEM HBsAg 即便采用抗 HBs 多克隆抗体仍不能测及7。这些发现均为本研究所印证。鉴于 122 和 160 位氨基酸二者同为决定 HBV 血清型的关键部位8, 本研究结果除表明重度抗原性漂移与变异部位高度相关外, 还提示某些特定部位（如抗 HBs G6 mAb 对应抗原位点）抗原性的漂移与 HBV 组决定簇存在某种特殊的关联。阻断实验结果显示, 抗 HBs A11 与抗 HBs MT mAb 所对应的是 2 个在血清学反应上相互独立的抗原位点, 抗 HBs G6 mAb 能阻断抗 HBs A11 与抗 HBs MT 二者对 rwHBsAg 的反应,
28、但其阻断能力不强, 对前者的阻断作用明显低于后者, 提示抗 HBs G6 mAb 所对应抗原决定簇在一级结构上与前二者无关, 且与抗 HBs A11 mAb 对应抗原位点的空间距离明显大于与抗 HBs MT mAb。鉴于抗 HBs A11 mAb 在我国早期 HBsAg ELISA 检测中应用较多, 其抗 HBV“a”决定簇（或其附近位点）特异性最为明确, 推测抗 HBs G6 mAb 所对应的抗原决定簇表位在氨基酸序列上与 HBV“a”决定簇存在一定的距离。资料还显示, 抗 HBs G6 对抗 HBs MT mAb 与rwHBsAg 结合的阻断效果明显低于对其与 G145R HBsAg 结合的阻断, 提示抗 HBs G6 mAb 对后者的亲和力至少不低于对 rwHBsAg 。而正是这种对 G145R 及其他 IEM HBsAg 的高亲和力特征彰显出该抗体在 IEM HBsAg临床诊断与流行病学研究中重要的理论与实用价值。【参考文献】1 Ly TD, ServantDelmas A, Bagot S, et al. Sensitivities of four new commercial hepatitis B virus surface
