1、均匀设计法优选藏药打箭菊中木犀草素提取条件作者：张凌，张道英，金晨，江雁，关媛媛【摘要】 目的优选藏药打箭菊中木犀草素的最佳提取条件。方法采用均匀设计实验，以高效液相色谱法测定木犀草素含量为指标，对影响木犀草素提取条件进行筛选。结果最佳提取条件为：用过 56 号筛的打箭菊粉末、加 50 倍量甲醇、水浴回流提取 1 h。结论打箭菊粉末粉碎度对木犀草素提取有较大影响。 【关键词】 打箭菊;木犀草素;均匀设计;高效液相色谱法Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction process of Luteolin in Flos Pyrethri Tatsien
2、ensis of Tibetan medicine.MethodsTo determine the content of Luteolin by homogeneous design to screen the condition of extracting the Luteolin from Flos Pyrethri Tatsienensis by HPLC.ResultsThe best extraction conditions were as follows: 80-100 head powder, 50 fold methanol, reflux-extracting for 1
3、hour.ConclusionThe comminution degree of Flos Pyrethri Tatsienensis has significant effect in extracting the Luteolin from Flos Pyrethri Tatsienensis.Key words： Flos Pyrethri Tatsienensis; Luteolin; Uniform design; HPLC打箭菊，又名鞑新菊或川西小黄菊，为菊科匹菊属(或小黄菊属)植物川西小黄菊 Pyrethrum tatsienense(Bur.et Franch.) Ling C
4、hrysanthemum tatsienense Bur.et Franch.的干燥头状花序1，生长于海拔 3 5005 000 m 高山草坡或灌丛林缘，分布于青海、四川、云南、西藏及甘肃等地，为一种常用藏药，其藏名为“阿加塞窘” “塞窘美多” 。性寒，味苦，无毒，具有活血、散淤、祛湿、消炎、止痛功能，其藏名“塞窘”就为解痛之意2，主要用于脑震荡、 “黄水病” 、瘟疫病、太阳穴头痛、跌打损伤和湿热疮疡。有文献报道，其主要含有木犀草素、木犀草素-7-O-D 葡萄糖苷、洋芹素、芫花素等黄酮类成分3。本作者在前期对打箭菊总提物的药效学初步研究中得出其具有良好的抗炎镇痛作用4，本文采用均匀设计实验，以
5、反相高效液相色谱法测定打箭菊中木犀草素含量为指标，探讨木犀草素提取影响因素，并筛选出最佳提取条件，为打箭菊中木犀草素提取条件和均匀设计法在中药提取条件优化中应用提供科学依据。1 仪器与试药1.1 仪器 Agilent 1100 型高效液相色谱仪;1/10 万电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司) ;SB3200 超声波清洗仪(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)1.2 试药木犀草素对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号为111520-200201);打箭菊药材由西藏藏医学院提供;所用试剂为分析纯;流动相用乙腈、甲醇为色谱纯，水为双蒸水。2 方法与结
6、果2.1 木犀草素的高效液相色谱分析方法52.1.1 色谱条件色谱柱为 Hypersil ODS2(250 mm4.6 mm ，5 m)，流动相为乙腈-0.7%冰醋酸(2575)，流速 1.0 ml/min，检测波长350 nm，柱温 30。理论塔板数以木犀草素计，应不低于 2 000。对照品色谱图见图 1，样品色谱图见图 2。图 1 对照品色谱图图 2 样品色谱图2.1.2 对照品溶液的制备精密称取木犀草素对照品 9.02 mg，置于100 ml 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成浓度为 0.090 2 mg/ml 的木犀草素对照品溶液，即得。2.1.3 线性关系的考察分别精密吸取木犀草素对
7、照品溶液0，1，2，4，6，8，10 ml，置于 10 ml 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，各进样 10 l，记录色谱图，依次测定峰面积，以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，得回归方程：Y=80.0+40 856.1X，R=0.999 3。结果表明，木犀草素在 00.902 0 mg/ml 范围内呈良好的线性关系。2.2 单因素实验考察提取条件2.2.1 不同提取时间的考察取打箭菊粉末(过 6 号筛)约 3 g，精密称定，置 150 ml 平底烧瓶中，加入甲醇 100 ml，分别按不同时间回流提取，滤过，用甲醇充分洗涤残渣，合并提取液及洗涤液，置水浴上挥干，加甲醇溶解，并定量转移至 25 m
8、l 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45 m 微孔滤膜，进样 10 l，进行比较，结果见图 3。由图 3 可以看出，提取时间为 1 h 时木犀草素的峰面积最大，所以应选择提取时间为 1 h。2.2.2 不同药材粉碎度的考察分别取不同粉碎度的打箭菊粉末约 3 g，精密称定，置 150 ml 平底烧瓶中，加入甲醇 50 ml，回流提取 1 h，滤过，用甲醇充分洗涤残渣，合并提取液及洗涤液，置水浴上挥干，加甲醇溶解，并定量转移至 25 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过 0.45 m 微孔滤膜，进样 10 l，进行比较。结果见图 4。图 3 不同提取时间对图 4 不同粉碎度对木犀草素含量的影响木
9、犀草素含量的影响由图 4 可以看出，打箭菊粉末通过 56 号筛时，木犀草素的峰面积最大，所以应选择过 56 号筛的粉末。2.2.3 不同溶剂量的考察取打箭菊粉末(过 56 号药典筛)约 1 g，精密称定，置 150 ml 平底烧瓶中，分别加入不同量的甲醇，回流提取 1h，滤过，用甲醇充分洗涤残渣，合并提取液及洗涤液，置水浴上挥干，加甲醇溶解，并定量转移至 25 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过 0.45 m 微孔滤膜，进样 10 l，进行比较。结果见图 5。图 5 不同溶剂量对 图 6 均匀设计木犀草素含量的影响模型拟合曲线由图 5 可以看出，溶剂量对木犀草素的峰面积影响不大，所以根据实际
10、情况，选择加甲醇量为 50 ml。2.2.4 单因素实验考察结论由单因素实验结果可知，木犀草素的最佳提取条件为：取过 56 号筛的药材粉末 1 g，加甲醇 50 ml，加热回流提取 1 h。2.3 均匀设计优选提取条件2.3.1 均匀设计选表分别选择药材粉碎度、料液比及提取时间 3 个因素，每个因素选择 6 个水平，编制因素水平表，见表 1。选择 U7(76)均匀设计表，根据其使用表的规定，选取其中 1，2，3 列，同时去掉最后 1 行，组成表 U6(63)。将对应的各因素的水平数填入表中，按表中安排的条件进行实验，实验安排见表 2。表 1 因素水平2.3.2 提取方法分别取不同粉碎度的打箭菊
11、粉末约 1 g，精密称定，置 150 ml 平底烧瓶中，按照表 2 中的要求加入不同量的甲醇，并按规定时间加热回流提取，滤过，用甲醇充分洗涤残渣，合并提取液与洗涤液，置水浴上挥干，加甲醇溶解，并定量转移至 25 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过 0.45 m 微孔滤膜，进样 10 l，进行比较，实验结果见表 2。表 2 均匀设计2.3.3 均匀设计结果分析采用 SAS 软件的非线性回归法对实验结果进行拟合6，根据拟合结果的决定系数(R2)和模型显著性检验 P 值调整模型拟合的参数，最后确定拟合的模型为：Y = -558.2X1 + 93.246 8X12 - 14210-16X120 +
12、900.4，R2=0.998 85，模型显著性检验结果P=0.001 7。从决定系数和模型检验结果来看，模型是可信的。依据拟合模型做拟合曲线，见图 6。由图 6 和模型决定系数可知，方程的拟合效果很好。峰面积只与药材粉碎度呈一定相关性，表现为 25 号筛孔对应的峰面积逐渐增大，6 号筛孔对应的峰面积最大，大于 6 号筛孔则峰面积又逐渐降低。回流时间和加甲醇量对峰面积的影响不大，且没有规律性。根据回归方程，确定溶液的最佳制备方法为：取过 56 号筛的药材粉末、加 50 倍量甲醇、回流提取 1 h。2.4 木犀草素的最佳提取条件由单因素实验及均匀设计的结果得出，打箭菊中木犀草素的最优提取条件为：取
13、打箭菊药材粉末(过 56 号筛)约 1 g，精密称定，置 150 ml 平底烧瓶中，加入甲醇 50 ml，回流提取 1 h。3 讨论在分别对提取方法(回流、索氏、超声)和提取溶剂(甲醇、乙醇、醋酸乙酯)单因素进行考察得出用甲醇回流提取的效果好的基础上，本论文通过对提取时间、药材粉碎程度、溶剂用量 3 因素和均匀设计实验分别对打箭菊中木犀草素提取条件优选，获得了最佳提取条件，有助于丰富打箭菊的基础研究，提高人们对藏药认识有一定的意义。均匀设计是一种多因素与多水平实验的设计方法，且让实验点在实验范围内均匀分布，与单因素实验相比，减少了实验次数，并能准确地预测优化实验条件和结果，具有方便、适用、预测
14、性好等特点，是中药成分提取条件优选一个非常实用的方法。藏药是在广泛吸收、融合了中医药学，印度医药学和大食医药学等理论的基础上，通过长期实践所形成的独特的医药体系，迄今已有上千年的历史，是我国较为完整、较有影响的民族药之一，它以其独特的疗效和天然的药效成分而倍受人们的关注和青睐。打箭菊是藏药中最常用的之一，但其基础研究报道很少，本研究为其资源的开发利用奠定了基础。【参考文献】1江纪武. 拉汉药用植物名称和检索手册M.北京：中国医药科技出版社，1990：1111.2周海钧. 中国民族药志，第 1 卷M.北京：人民卫生出版社，1990：172.3杨爱梅，刘霞，鲁润华，等. 藏药川西小黄菊中黄酮类成分的分离与结构鉴定J.中草药，2006，37(1)：25.4张凌，张道英. 藏药打箭菊抗炎镇痛作用的研究J.第九届全国中药和天然药物学术研讨会论文集，南昌，2007，12：380.5张凌，张道英. 藏药打箭菊中总黄酮及木犀草素的含量测定J.药物分析，2008，28(5)：99.6周仁郁.SPSS13.0 统计软件M.西安：西南交通大学出版社，2005：113.
