1、卡配因 I 细胞周期依赖性蛋白激酶 5 通路在血管性痴呆小鼠海马中的变化作者：王天俊 吕佩源 王贺波 郭宗成 尹昱 张和振 刘昌林 梁翠萍【摘要】 目的 观察脑缺血 再灌注导致的血管性痴呆小鼠不同时间点海马组织卡配因 I(Calpain I) 细胞周期依赖性蛋白激酶 5(Cdk5)通路表达的变化。方法 雄性昆明小鼠 160 只，随机分为假手术组(n=65)和模型组(n=95)。采用双侧颈总动脉反复缺血 再灌注的方法制备血管性痴呆(VD)模型。术后第 4 周和第 6 周应用水迷宫实验进行行为学测试，免疫组化观察海马 CA1 区 Calpain I 的表达，RTPCR 观察 Cdk5 的 mRNA
2、表达，Westernblot 检测 Cdk5 的蛋白表达。结果 术后第 4 周和 6 周时模型组小鼠的学习、记忆成绩均明显劣于假手术组小鼠(P0.05)。术后第 4 周模型组海马 CA1 区神经元 Calpain I 表达的平均光密度值(0.090 00.010 0)较假手术组(0.033 20.004 3)显著增高(P0.05)，Cdk5 mRNA 表达(0.910.07)较假手术组(0.350.02)显著增高(P0.05);术后第 6 周模型组海马 Calpain I 表达的平均光密度值(0.104 00.008 4)较假手术组(0.032 70.004 5)显著增高(P0.05)，Cdk
3、5 mRNA 表达较假手术组显著增高(0.800.07 vs 0.530.05，P0.05)。结论 Calpain ICdk5 通路参与了脑缺血再灌注后小鼠 VD 的发生。 【关键词】 脑缺血 再灌注;痴呆;卡配因;细胞周期依赖性蛋白激酶5【Abstract】 Objective To observe the changes of the expression of Calpain I cyclindependent protein kinase 5 (Cdk5) pathway at different time points following cerebral ischemia and
4、reperfusion. Methods 160 male Kunming mice were randomly divided into sham and model groups. Vascular dementia (VD) mice model was made by three times of transient ischemia and reperfusion of bilateral common carotid arteries. The behavioral tests were examined respectively at 4, 6 w post surgery. T
5、he expression of Calpain I in hippocampal CA1 was measured by immunohistochemistry staining. Cdk5 mRNA was examined by RTPCR. Western blot was used to evaluate Cdk5 protein expression. Results Compared with those in sham group， the abilities of learning and memory of animals in model group were dama
6、ged significantly(P0.05) at 4, 6 w post surgery. At 4 w，the OD value of Calpain I in model group was higher than that of sham group(0.090 00.010 0 vs 0.033 20.004 3), and there was significant differene between the two groups(P0.05). The expression of Cdk5 mRNA in model group was higher than that of
7、 sham group(0.910.07 vs 0.350.02 ，P0.05). At 6 w，the OD value of Calpain I in model group was higher than that of sham group(0.104 00.008 4 vs 0.032 70.004 5，P0.05). The expression of Cdk5 mRNA in model group was also significantly higher than that of sham group(0.800.07 vs 0.530.05 ，P0.05). Conclus
8、ions Calpain I Cdk5 pathway is involved in the occurrence of VD in mouse following cerebral ischemia and reperfusion.【Key words】 Ischemia and reperfusion;Vascular dementia;Calpain I ;Cyclindependent protein kinase 5细胞周期依赖性蛋白激酶 5( Cyclindependent protein kinase 5，Cdk5)是细胞周期依赖性激酶家族中的一员，研究表明 Cdk5通过磷酸化其
9、底物，控制多种激酶和信号转导通路，参与学习和记忆的形成1 ，对脑的发育和功能具有重要意义。除正常的生理功能外，Cdk5 还参与了多种神经变性病的发生。在 AD 患者死后脑的样本中发现Cdk5 活性增高2 ，脑缺血后神经元死亡也 Cdk5 激活有关3 。目前研究提示 Cdk5 既参与记忆的形成，又与脑缺血损伤有关，而血管性痴呆(VD)大多继发于缺血性脑血管病之后，提示 Cdk5 可能参与了脑血管病后学习、记忆障碍的发生。目前有关该酶在 VD 中的作用尚少见报道。本研究应用反复脑缺血再灌注合并尾部放血的方法建立 VD 小鼠模型，测试小鼠学习和记忆能力，观察小鼠海马组织卡配因 I(Calpain I
10、)和 Cdk5 的表达，探讨 Calpain ICdk5 通路在 VD 发病中的作用。1 材料与方法1.1 动物 3 月龄雄性昆明小鼠 160 只，购自河北省实验动物中心，合格证号：801032，体重 (32.53.0) g。随机分为即假手术组(65 只)和 VD 模型组(95 只)。1.2 试剂及仪器 小鼠水迷宫自动记录仪由中国医学科学院药研所制造，Calpain I 免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司，Cdk5(C8) 抗体购于 Santa Cruz 公司，蛋白质定量试剂盒和 RIPA 裂解缓冲液试剂盒购于普利来基因技术有限公司，Trizol、cDNA 反转录及 PCR 扩增试剂均为天根生物
11、公司产品。引物根据 GenBank 提供的模板，由上海生工生物工程技术有限公司设计合成，Cdk5 引物序列：上游：5GCACCTATGGAACTGTGTTCAAG3;下游：5CTTCACAATCTCAGGGTCCAGG3。actin 引物序列：上游：5GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA3;下游：5CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC3。1.3 模型制备 手术操作参照文献4方法，并略做改动。将小鼠用 10%水合氯醛 0.035 ml/10 g 腹腔注射麻醉，分离双侧颈总动脉，以 40 号丝线阻断血流 30 min，同时在距鼠尾尖约 1 cm 处断尾，放血约 0.3 ml。松开
12、丝线扣恢复血流 10 min 后，再次阻断血流 30 min，如此重复 3 次，第 3 次血流再灌注后观察 30 min 后缝合皮肤。假手术组仅分离双侧颈总动脉，套丝线;但不阻断血流，喜部不放血。分别在术后 4 w 和 6 w 两个时间点对两组动物进行观察。1.4 行为学测试 应用水迷宫进行行为测试，记录小鼠游完全程的时间和进入盲端的次数(错误次数)，3 min 内不能游出者按 3 min 计。术后 4 w 时，各组取部分小鼠进行测试，术后第 29 天的测试成绩为学习成绩，第 30 天直接让小鼠游水迷宫进行测试，记录其游完全程时间及错误次数，作为记忆成绩。术后 6 w 时，取各组剩余部分的小鼠
13、进行水迷宫实验，第 43 天的成绩为学习成绩，第 44 天的成绩为记忆成绩。1.5 Calpain I 表达的检测 行为学测试结束后分别于术后第 30 天和第 44 天，每组选 5 只小鼠经心脏灌注固定，取视交叉至乳头体之间的脑组织，置于 4%多聚甲醛溶液中外固定 24 h，梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，连续冠状切片，片厚约 5 m。严格参照免疫组化试剂盒进行操作。所有切片均在 Motic Med 6.0 数码医学图像分析系统内在相同的放大倍数下观察，每个切片计数 10 个视野，Calpain I 以阳性细胞染色的平均光密度(OD)值来表示抗原表达量。1.6 Cdk5 mRNA 表达的
14、检测 手术后 4 w 和 6 w 的行为学测试结束后，分别取假手术组和模型组各 8 只小鼠，麻醉后断头，冰上取海马，参照文献5方法进行 mRNA 测定。按 Trizol 试剂说明提取组织总RNA，采用逆转录试剂盒按操作说明书逆转录为 cDNA，以逆转录所得cDNA 为模板进行 PCR 扩增。扩增片段长度为 275 bp。反应体系 20 l，PCR 条件：94 5 min，94 45 s，55 45 s，72 45 s，35个循环后 72延伸 5 min。PCR 产物以 1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外透射灯下观察照相，用凝胶图像扫描分析系统扫描凝胶得到内参对照actin 和 Cdk5 的电泳条
15、带光密度，通过 Cdk5/actin 的光密度比值做相对定量分析。1.7 Cdk5 蛋白测定 参照文献6方法。将冻存于液氮中的海马组织研磨，按 RIPA 裂解缓冲液试剂盒说明书进行裂解，用 BCA 法进行蛋白定量。以 15%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至 PVDF 膜，室温下封闭液封闭 1 h 后，加入用封闭液稀释的单克隆抗体一抗(actin ，11 000)和多克隆抗体(Cdk5，C8，1400 稀释)，4孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的抗兔或鼠 IgG 二抗(11 000 稀释)反应2 h，ECL 显影。actin 作为内参照。实验重复 3 次，凝胶图像分析仪进行点密度分析。1.8
16、统计学处理 数据以 xs 表示，运用 SPSS13.0 软件进行处理，采用单因素方差分析，并采用 LSD 检验进行组间比较。2 结 果2.1 一般情况 假手术组小鼠 65 只，术后死亡 5 只，死亡率7.69%。模型组小鼠 95 只，术后死亡 35 只，死亡率 36.84%，存活小鼠表现精神萎靡不振，毛色不光华，有转圈、轻度共济失调，术后 2 w 后表现正常，无死亡发生。2.2 行为学测试结果 术后 4 w 水迷宫测试结果提示，与假手术组比较模型组术后第 29 和 30 天小鼠游完全程时间明显延长(P0.05)，错误次数增多(P0.05)(表 1);术后 6 w 时，与假手术组相比，模型组术后
17、第 43、44 天小鼠游完全程时间明显延长(P0.05)，错误次数增多(P0.05)(表 2)。表 1 术后 4 w 两组小鼠水迷宫试验的学习和记忆成绩与假手术组比较：1)P0.05，下表同表 2 术后 6 w 两组小鼠水迷宫试验的学习和记忆成绩2.3 免疫组化检查结果 假手术组术后 4 w 和 6 w 时小鼠海马 CA1区细胞层次清晰，排列整齐，细胞呈圆形，胞浆内仅有微量 Calpain I的表达;模型组术后 4 w 神经元排列紊乱、层次不清、胞核深染，胞浆内Calpain I 表达明显增多;术后 6 w 时神经细胞数目减少、排列紊乱。胞核深染、固缩，核仁消失，胞浆内 Calpain I 表
18、达明显增多。模型组在术后 4、6 w 神经元胞浆内 Calpain I 的表达较假手术组均显著增高，尤以术后 6 w 时增高明显 (图 1)。各组平均光密度值的比较见表 3。表 3 术后 4、6 w 两组小鼠海马 CA1 区神经元 Calpain I 平均光密度值2.4 术后 4、6 w 时海马组织 Cdk5 的 mRNA 表达 术后 4w 时模型组海马组织 Cdk5 mRNA 表达较假手术组显著增高(P0.05)，这一现象持续至术后 6 w 时仍未恢复，即术后 6 w 模型组海马的 Cdk5 mRNA 表达较假手术组亦显著增高(P0.05)(图 2、表 4)。表 4 术后 4、6 w 各组小
19、鼠 Cdk5 mRNA 结果2.5 术后 4 w 和 6 w 时海马组织 Cdk5 蛋白的表达 经点密度分析发现模型组在术后 4 w 和 6 w 时小鼠海马组织 Cdk5 表达较假手术组显著增高(P0.05)(表 5，图 3)。表 5 各组小鼠海马组织 Cdk5 蛋白表达的比较3 讨 论模拟人类缺血性脑血管病的发病过程，建立重复性好、生理指标控制严格的 VD 动物模型对于深入探讨其病因特点、早期诊断及治疗等均有重要意义。本研究采用小鼠作为观察对象，应用反复脑缺血 再灌注合并尾端放血方法制备的 VD 动物模型在术后 4 w 的学习和记忆成绩较假手术组显著降低，且这一现象持续至术后 6 w 仍未恢
20、复，提示已造成对缺血敏感区脑组织持续而严重的损害，进而影响学习和记忆能力。由于本模型能较好模拟人的 VD 发生，且手术操作简单，重复性好，便于进行智能测试，因此是较理想的 VD 模型之一。Calpain 是钙离子依赖的中性蛋白酶，位于细胞质中，哺乳动物组织中广泛存在的 Calpain 异构体有两种，依据对 Ca2+敏感性的不同，分为 uCalpain( 又称 Calpain I)，可被微摩尔级的 Ca2+激活，mCalpain( 又称 Calpain II)可被毫摩尔级的 Ca2+激活7 。生理状态下，Calpain 参与机体对衰老和变性细胞的清除;病理状态下，细胞内出现持续钙超载，激活大部分
21、 Calpain，使其对细胞酶产生过度降解，引起细胞结构与功能异常及细胞死亡8 。张红等9研究发现大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞出现凋亡，Calpain mRNA 表达增加。本研究发现反复脑缺血 再灌注后 4 w 小鼠海马 CA1 区神经细胞层次不清、排列紊乱，Calpain I 表达显著增高，这种异常表现呈持续性，至术后 6 w 更明显，神经元数目减少、胞核深染、固缩，核仁消失，胞浆内 calpain I 表达较假手术组明显增多，并略高于术后第 4 周的模型组小鼠，提示Calpain I 参与了 VD 小鼠海马神经元的死亡。位于细胞质中的 Calpain 处于非激活状态，当细胞内钙离子水平
22、升高时可被激活8 。在病理条件下，细胞内出现持续钙超载，激活大部分 Calpain，使 p35 裂解为 p25，p25 作为 Cdk5 的激活因子，可引起培养的神经元出现细胞死亡，使前脑表达 p25 的转基因小鼠(CKp25) 在出生后显示严重的神经变性10 。黄天文等11发现原代培养的皮质神经元中，A2535 可引起 Calpain 活性增加，导致 p25 大量生成，Cdk5激酶活性异常增高，促进 tau 蛋白过度磷酸化而破坏微管骨架的稳定。本研究发现在脑缺血再灌注后 4 w 和 6 w 时海马组织 Cdk5 mRNA 和蛋白表达均显著增高，与 Calpain I 的增高和学习记忆损害相一致
23、，提示Cdk5 的异常增高参与了 VD 的发生。这与以往的研究相似12 。本研究表明，缺血再灌注可引起海马组织神经元持续进行性损害，伴 Calpain I 表达持续异常增高，Calpain I 的下游产物 Cdk5 的 mRNA 表达和蛋白表达亦显著升高，提示 Calpain I Cdk5 通路可能参与了脑缺血再灌注后 VD 的发生。分析其可能的原因：反复脑缺血 再灌注导致神经元钙平衡被破坏，使胞浆内钙离子浓度增加，出现钙超载，激活Calpain I，异常活化的 Calpain I 促使 p35 向 p25 的裂解增多，p25 与Cdk5 相结合使其活性失调，导致 Cdk5 不能对突触前、突触
24、后和 NMDA 受体等多种突触相关物质发挥正常生理作用，进而影响学习和记忆功能，引起痴呆的发生。本研究对 VD 小鼠海马 Calpain ICdk5 通路的表达进行了观察，有关这两种激酶活性的改变以及在 VD 中导致细胞死亡的具体机制尚有待进一步阐明。【参考文献】1 Angelo M，Plattner F，Giese KP.Cyclindependent kinase 5 in synaptic plasticity，learning and memoryJ.J Neurochem，2006;99(2)：35370.2 Patrick GN，Zukerberg L，Nikolic M.Conv
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