1、卡维地洛抗动脉粥样硬化作用的研究【摘要】 目的 探讨卡维地洛在动脉粥样硬化病变中的抗氧化作用及其对增殖细胞核抗原（PCNA）及核因子 kappaBp65（NFBp65）活化的影响。方法 雄性新西兰大耳白兔 24 只，随机分为正常组、高脂组、卡维地洛组，每组 8 只，共计喂养 10 周。实验结束后，酶法检测各组家兔的血清三酰甘油及胆固醇，黄嘌呤氧化法检测血清超氧化物歧化酶（SOD） ，硫代巴比妥酸比色法检测丙二醛（MDA）,并采用免疫组化的方法测定血管壁 PCNA 及 NFBp65 的表达。结果 高脂组和卡维地洛组血清三酰甘油和胆固醇较正常组明显升高（F=146.25、287.83,q=14.7
2、620.75,P0.01） ，而该两组间差别无统计学意义（q=0.53、0.59,P0.05） 。高脂组较正常组 SOD 明显降低，MDA 明显增加，而卡维地洛组较高脂组 SOD 有所升高，MDA 有所降低（F=21.65、75.64,q=4.9824.29,P0.01） 。高脂组 PCNA 和NFBp65 的表达较正常组明显增加，卡维地洛组 PCNA 和 NFBp65 的表达较高脂组明显减少（F=426.12、521.38,q=56.1575.87,P0.01） 。PCNA 和 NFBp65 的呈正相关（r=0.975，P0.01） 。结论 卡维地洛有减轻脂质过氧化损伤的作用，可阻断 NFB
3、 的活化，进而抑制平滑肌细胞的增殖。 【关键词】 动脉硬化 卡维地洛 抗氧化剂 细胞增殖 兔 ABSTRACTObjectiveTo study the effect of carvedilol on antioxidation and activation of PCAN and NFB on atherosclerosis.MethodsTwentyfour male New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups: normal group, highfat diet group and cavedilo
4、ltreated group, with eight rabbits in each group. All the rabbits were fed for 10 weeks. After completion of the experiment, the levels of serum triglyceride and cholesterol were measured by enzymatic method, of serum SOD by xanthine oxidative technique, and of serum MDA by thiobarbituric acid metho
5、d. Expression of the PCAN and NFBp65 in the vascular wall was detected immunohistochemically. ResultsCompared with those of normal rabbits, the levels of serum triglyceride and cholesterol of the highfat diet and cavediloltreated were extremely high （F=146.25，287.83； q=14.76-20.75； P0.01), but no st
6、atistical difference was found between the latter two groups （q=0.53，0.59; P0.05). Lowlevel serum SOD and highlevel serum MDA were noticed in highfat diet rabbits. In highfat diet group, SOD was lower than that in normal group, and MDA was higher; in cavediloltreated group, SOD was higher, and MDA w
7、as lower as compared with normal group （F=21.65，75.64; q=4.98-24.29; P0.01）. The expression of PCNA and NFBp65 in highfat diet group was markedly increased as compared with the normal group; but the expression was decreased in carvedilol group as compared with highfat diet （F=426.12，521.38; q=56.15-
8、75.87； P0.01）. An analysis showed that a positive correlation existed between PCNA and NFBp65. Conclusion Carvedilol might relieve the lipid peroxidation injury and block NFB activation so as to inhibit the proliferation of smooth muscle cells. KEY WORDS atherosclerosis; carvedilol; antioxidants; ce
9、ll proliferation; rabbits 动脉粥样硬化(AS)是许多心脑血管疾病的基础性病理表现,也是中老年人常见疾病之一，严重威胁着人类的健康。氧化损伤是 AS 病变过程中核心环节，而平滑肌细胞的迁移增殖是斑块形成、管腔狭窄的直接原因。卡维地洛是具有多种药理活性的第三代 受体阻滞剂，除具有非选择性 受体阻滞作用外，还有 1 受体阻断作用。近年来的研究表明，卡维地洛具有较强的抗氧化作用，这使其在抗 AS 病变中具有重要意义。本实验通过高脂饮食加免疫损伤内皮的方法诱发家兔 AS 模型，观察卡维地洛对 AS 病变过程中脂质过氧化损伤、增殖细胞核抗原（PCNA）及核因子kappaBp65（
10、NFBp65）表达的影响，进一步阐述其抗 AS 作用机制，从而为临床治疗 AS 提供依据。 1 材料与方法 1.1 药物和试剂 卡维地洛（金洛）由齐鲁制药有限公司提供，批准文号：国药准字H20000100；超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；PCNA 和 NFBp65 及相关 SP 试剂盒购自武汉博士德生物工程研究所。 1.2 主要仪器 上海精密仪器厂 721 型分光光度计，美国 Lambert 公司石蜡切片机，日本 Olympus 公司显微照相装置，德国欧波同公司 VIDAS 21 图像分析系统。 1.3 实验动物分组 健康雄性新西兰大耳白兔 24 只
11、（购于华中科技大学同济医学院实验动物学部，合格证号：医动字第 19025 号） ，体质量（2.500.25）kg，分笼饲养，随机分为正常组、高脂组、卡维地洛组，每组 8 只。 1.4 模型的制备及药物干预 家兔适应性喂养 1 周后，高脂组和卡维地洛组均一次性经耳缘静脉注射牛血清清蛋白 250 mg/kg，然后均行高脂饮食。高脂饲料配方为：1 g 胆固醇+5 g 猪油+94 g 普通饲料。另外，卡维地洛组每日清晨行卡维地洛 10 mg/kg 灌胃。正常组行普通饲料喂养（100 mg/d） 。各组家兔共喂养 10 周。 1.5 血液标本的采集及测定 喂养 10 周后，各组动物分别行 250 g/L
12、 乌拉坦（4 mL/kg）腹腔麻醉，沿胸骨正中线纵向剖开胸腔暴露心脏，直视下行右心室穿刺抽血，酶法检测各组家兔的血清三酰甘油及胆固醇，黄嘌呤氧化法检测血清SOD，硫代巴比妥酸比色法检测 MDA，各操作步骤严格按说明书进行。 1.6 局部病理标本的取材及检测 全血采集完毕后气胸处死动物，游离主动脉至髂总动脉分叉处，仔细清除血管壁脂肪及结缔组织，纵向剖开血管壁暴露内膜表面，铺平。高脂组、卡维地洛组在主动脉弓病变处取材，大小约 1.0 cm0.5 cm，正常组亦在主动脉弓处取材，其大小也约 1.0 cm0.5 cm，分别放入100 g/L 中性多聚甲醛中固定，并逐步脱水，透明，浸蜡，包埋制成蜡块。每
13、一标本连续切片两张，分别行 PCNA 及 NFBp65 免疫组化检测，免疫组化采用 SP 法，DAB 显色，操作步骤严格按照说明书进行。 PCNA 及 NFBp65 阳性表达主要在细胞核内，VIDAS 21 计算机图像分析系统测定一定面积阳性信号值和阳性信号平均吸光度，并计算二者乘积，即积分吸光度。测定时每一病理切片在高倍镜下随机取 10 个视野，取其平均值。 1.7 统计学分析 数据以s 表示，用 SPSS 11.5 进行方差分析，变量间相关性检验采用直线相关分析。 2 结 果 2.1 各组三酰甘油和胆固醇水平比较 高脂组、卡维地洛组血清三酰甘油及胆固醇水平均明显高于正常对照组（F=146.
14、25、287.83,q=14.7620.75,P0.01） ，而两组之间差别无统计学意义（q=0.53、0.59,P0.05） 。见表 1。 2.2 各组血清 SOD 活性和 MDA 含量比较 高脂组 SOD 活性较正常组明显降低，MDA 明显增加，而卡维地洛组SOD 较高脂组则有所升高，MDA 有所降低，差别有高度统计学意义（F=21.65、75.64,q=4.9824.29,P0.01） 。见表 2。 2.3 免疫组化检测结果 PCNA 和 NFBp65 阳性染色定位于细胞核，染成棕褐色，正常组阳性着色很少见。高脂组 PCNA 和 NFBp65 阳性染色主要分布在内膜及中膜靠近内膜处，较正
15、常组和卡维地洛组明显增多，差别有高度统计学意义（F=426.12、521.38,q=56.1575.87,P0.01） 。见表 3。相关分析结果，PCNA 与 NFBp65 呈正相关（r=0.975，P0.01） 。表 1 各组家兔血脂水平比较表 2 各组家兔血清 SOD 及 MDA 水平比较表 3 各组家兔主动脉血管壁 PCNA 及 NFBp65 半定量结果比较 3 讨 论 AS 为一较为复杂的病理学进程，其核心机制为脂质过氧化损伤血管壁，而平滑肌细胞的迁移增殖是斑块形成、管腔狭窄的直接原因。卡维地洛具有明显的抗氧化效应，因此在抑制 AS 病变的过程中发挥重要的作用。 3.1 卡维地洛对血脂
16、及脂质过氧化的影响 AS 病变形成的一个常见原因即为高脂血症，本实验的研究结果显示，卡维地洛对血三酰甘油及胆固醇无明显影响，说明其抗 AS 作用不是通过影响血脂代谢而实现的。SOD 与 MDA 是反映 AS 进展过程中氧化损伤的可靠指标。SOD 是体内维持氧自由基产生与灭活的主要酶类，是清除氧自由基的“清道夫” ；MDA 是脂质过氧化生成的一种醛基，AS 时其在血液中含量直接反映出氧化损伤的程度。本实验研究结果表明，AS 病变过程中存在脂质过氧化现象，而卡维地洛具有明显的抗氧化效应。目前的研究表明，卡维地洛抗氧化作用的活性部位为其分子结构上的咔唑基，其抗氧化作用的机制主要表现为：抑制内源性抗氧
17、化剂 Vit E 和谷胱甘肽的清除；与细胞膜上的 Fe3+螯合，从而阻止由 DHF/Fe3+ADP 和 Fe/Vit C 介导的氧自由基产生及其所致细胞膜上 LDL 氧化1 ；作用于膜磷脂，降低膜对自由基的亲和性,并能镶嵌在脂质双层膜较深的位点上，使咔唑基接近脂质氧化的非饱和脂肪酸侧链的位点,从而发挥其抗氧化作用。此外，卡维地洛的代谢产物（SB211475 和 SB209995）抗氧化作用是卡维地洛的 3080 倍,是 Vit E 的 1 00010 000 倍2 。 3.2 卡维地洛对 PCNA 和 NFBp65 表达的影响 PCNA 又称周期素,主要表达于处在增殖状态的细胞。细胞周期受控于
18、PCNA,它作为生长因子的感受器,与周期蛋白依赖性激酶结合为外源信号的整合器,诱导蛋白磷酸化,从而调控细胞周期进程3 。NFB 是将信息从胞浆传至胞核引起相应基因表达的重要的转录因子，它是由多肽链 p65和 p50 蛋白亚基构成的二聚体,包括 p50 二聚体、p65 二聚体和 p50p65异源二聚体,主要发挥生理作用的是 p50p65 异源二聚体4 。本实验即通过检测 NFBp65 以明确 AS 病变中 NFB 的活化程度。细胞处于静止状态时 NFB 位于细胞质中，当机体受到外界因素如细胞因子、磷脂、脂糖、病毒、植物凝集素刺激时,在蛋白激酶核蛋白磷酸酶的作用下,IkB发生磷酸化,从 NFB 二
19、聚体上解离暴露 p50 单靶的核定位信号,NFB 得以激活,并移位入细胞核,与 DNA 链上调控众多因子转录的启动位点特异结合,启动基因转录5 。有研究表明，在有丝分裂原（Ang、FGF 等）诱发的平滑肌细胞增殖的过程中，存在蛋白激酶 C（PKC）NFB 信号转导通路，NFB 活化后可以结合在细胞 cyclinD1 的启动子而激活其转录，从而介导平滑肌细胞的增殖6 。本实验的研究结果显示，NFBp65 与 PCNA 呈正相关，也说明了 NFB 可介导平滑肌细胞的增殖。卡维地洛抑制 NFB 活化的作用可能与其抗氧化效应有关。HINZ 等7研究发现，氧自由基可使 IkB 磷酸化降解而游离出 NFB
20、 进入核内,从而发挥其促平滑肌细胞增殖的作用。卡维地洛强烈的抗氧化作用，可清除AS 病变过程中氧化损伤所释放的氧自由基，进而阻断其 NFB 的活化，由此可抑制平滑肌细胞增殖。 总之，卡维地洛抗 AS 作用与其抗氧化作用密切相关，主要表现为抑制 AS 病变过程中的脂质过氧化，清除氧自由基，阻断 NFB 的活化，进而阻断平滑肌细胞的增殖。 【参考文献】 1OLIVERA P J， COXITO P M， RELO A P， et al. Inhibitory effect of carvedilol in the highconductance state of the mitochondrial
21、 permeability transition pore J. Eur J Pharmacol，2001，412（3）：231237. 2OETTL K, GREILBERGER J， ZANGGERR K， et al. Radicalscavenging and ironchelating properties of carvedilol，an antihypertensive drug with antioxiditive activity J. Biochem Pharmacal， 2001，62（2）：241248. 3RANGANNA K， YATSU F M， HAYES B
22、E， et al. Butyrate inhibit proliferationinduced proliferating cell nuclear antigen expression (PCNA) in rat vascular smooth muscle cells J. Mol Cell Biochem， 2000，205(1/2)：149. 4RITCHIE M E. Nuclear factor B is selectively and markedly activated in humans with unstable angina pectoris J. Circulation
23、, 1998,98:17071713. 5GUTTRIDGE D C, ALBANESE C, REUTHER J Y, et al. NFkappa B controls cell growth and differentiation through transcriptional regulation of cyclinD1 J. Mol Cell Biol, 1999,19(8):57855789. 6RAMANA KV， CHANDRA D， SRIVASTAVA B， et al. Aldose reductase mediates mitogenic signaling in vascular smooth muscle cells J. J Biol Chem， 2002，277（35）：3206332070. 7HINZ M， KRAPPMAMN A. NFB function in growth control: regulation of cyclin D1 expression and G0G1 to S2 phase transition J. Mol Cell Biol， 1999，19：2690.
