1、生化分析常见交叉污染探讨与对策徐国超,一如何理解交叉污染,在A项目测定中所使用的试剂、样本、反应产物、清洗剂等对B项目的测定产生了不良影响的现象。A项目与B项目不一定是相邻项目。,测试项目A,试剂、样本等残留,测试项目B,引发交叉污染的原因,生化仪的发展变化多项目,多样本处理处理能力的提高(高速化)设计共用机械部分样本针,试剂针比色杯搅拌棒,生化仪状态不良,使用不当清洗力的低下(日常维护欠缺,仪器老化)生化仪内污垢的积聚测试顺序安排不当常规清洗不能有效消除污染,二交叉污染的分类,样本针携带污染试剂针携带污染搅拌棒携带污染清洗系统携带污染比色杯污染 试剂交叉污染,三不同类型交叉污染的鉴别方法及原
2、因,1. 样本针携带污染： 目前大多数全自动生化分析仪采用循环冲洗式样本针吸取样本，当样本针在清洗不完全，或黏附力增加时，样本残留可能会对下一相邻样本的检测结果造成影响。原因：样品针尖弯曲，特富龙涂层剥落，针堵塞，冲洗水冲洗不充分携带污染率主要是体现样品之间的污染程度,样本针携带污染率试验（一）,同一检测项目浓度相差较大的a标本（高浓度），b标本（低浓度）。检测顺序：a 1 , a 2 , b 1 ,b 2 , b3计算：评价： 以q小于10%为判断标准。局限性：结果与选择的标本浓度有关系例1：选择高浓度的ALT样本浓度值为2020 U/L，低浓度ALT 样本第一次检测结果40 U/L，第三次
3、检测结果20 U/L。通过计算携带污染率q = （40 20）/ 2000 * 100% = 1%。例2：选择高浓度的Cl 样本浓度值为140 mmol/L，低浓度Cl 样本第一次检测结果为86 mmol/L，第三次检测结果为80 mmol/L。通过计算携带污染率q = （86 80）/ 60 * 100% = 10%。上例中，例1的携带污染率尽管只有1%，由于结果正好在医学决定水平附近因此对临床判断有较大影响。例2的携带污 染率尽管达到了10%，但是对于临床判断不会产生大的影响。因此，使用该方法评价样本针携带污染需考虑样本的实际浓度。,测试顺序：3L 2H 1L 2H 4L 2H 1L 2H
4、 1L 2H 1L（注上述顺序前的数字代表测试数量，如3L代表连续测试3个低值样本）定义：L L 值为紧跟在低值标本后低值标本的结果。H L 值为紧跟在高值标本后低值样本的结果携带污染指标= H L结果的平均值 L L结果的平均值判断标准：当携带污染指标小于 3SD SD是 ( L L ) 结果的SD值。,样本针携带污染率试验（二）,试剂针携带污染,全自动生化分析仪一般采用双试剂针，即所有项目的一试剂都共用试剂针R1，所有项目的二试剂都共用试剂针R2。试剂针R1或R2在每吸取一次试剂后都会进行一次清洗，之后会 立即吸取下一个项目的试剂。当自身清洗能力下降，试剂针在吸取试剂时会将部分残留的前项目
5、试剂成分带入到后项 目反应杯中，对后项目的检测结果造成影响。从各个项目设置的参数可知，试剂体积量远大于样本体积量。因此试剂针携带污染影响程度会高于样本针携带污染。,携带污染实验方案,目前大部分实验室开展的生化检测项目至少都有20项以上，评价全项目之间的携带污染会非常耗时，试剂成本消耗量大。且不同仪器的动作原理不完全相同，设计一个较为简单，合理的实验方法是需要重点考虑的 内容。试剂针携带污染实验方案原理：通过设置特定的标本检测顺序，每个样本只做一个项目的检测，可以控制不同项目的先后吸取顺序，实现任何一个 项目都能与其他项目相遇。为了有效评价项目之间携带污染影响程度，污染实验所用病人样本的混合血清
6、应尽量包含医学决定水平浓度,试剂针携带污染实验方法,携带污染初实验假设本次实验以A, B, C, D, E五个项目来考察各个项目之间的试剂针携带污染,先在生化仪中输入样本测试号码和选择项目，每个样本号码只选择一个项目，目的是使试剂针吸取项目的顺序 完全按照样本测试号码的先后顺序进行，五个项目的测试 顺序见表1。测试完成后，将数据输入到处理表格2和表格3中，按照一定的判断标准，寻找可能存在的污染项目组合。,表3中显示了试剂之间携带污染初实验后的结果:a 将表格内测试顺序号代表的位置处输入该项目对应的测试结果，b 对每个测试顺序号下面对应的测试结果和该项目单独5次重复结果的均值相比比值以百分比形式
7、表示，通过考察百分比的大小来初步判断携带污染的可能性。目前的判断标准以正负百分之五作为判断标准，超过范围时怀疑有携带污染。,试剂针携带污染确认实验,由携带污染初实验筛选出怀疑有污染的项目组合， 假设 (AB) 同(DE)即A项目对B项目（A项目做好后紧接着做B项目），D项目对E项目（D项目做好后紧接着做E项目）怀疑有污染。由于初实验的项目交叉结果只是一次测试的结果， 可能有偶然因素，还必须进行确认实验。以(AB)为例，(DE)的情况相同先单独做A项目，紧接着连续测试3次B项目，第一个B项目的结果受A项目影响最大，第三个B项目的结果因为有2次自身冲洗，结果应比较准确。比较第一个B项目检测结果同第
8、三个B项目检测结果，如果影响百分比同初试结果影响趋势和程度相近，可以判断 A项目对B项目有携带污染。确认实验检测顺序以(AB ）, (DE)为例确认实验步骤（表4）A B1 B2 B3 D E1 E2 E3,搅拌棒污染：试剂与样本、第一试剂与第二试剂的混 匀需要搅拌棒，而搅拌棒如果清洗不完全，或黏附力增加时，残留试剂可能会对下一检测结果造成影响。鉴别对同一份血清标本重复测定GGT 或ALT或AST20次以上，结果重复性较差且有走高趋势。原因 搅拌棒特富龙涂层剥落，搅拌棒表面有顽固性污渍，冲洗水冲洗不充分, 可用无水乙醇擦洗搅拌棒,搅拌棒携带污染,4.清洗系统携带污染 鉴别：在样本测定过程中加做
9、室内质控，部分项目测定异常或者失控在样本测定过程中以蒸馏水为样本，多次测定LDH、P、M、TBA，结果重复性不好。原因：干燥棒携带污染为多,5.比色杯污染 生化分析仪的比色杯大体分为两种，一 种是循环使用的（如石英比色杯等），另一种是需要定期更换的（如塑料比色杯等），每个比色杯检测完毕后，进行清洗，然后继续下一个检测项目的检测。当由于 各种原因导致某个比色杯清洗不完全或该比色杯老化时，吸附在比色杯上的上一个项目的残留试剂可能会对在这个比色杯中进行的下一个项目的检测结果造成影响。 根据经验，比色杯的污染对结果影响最大，因为比色杯最难以清洗干净，且在实际工作中难以判断该比色杯上一测试的项目。 鉴别
10、：在每日早晨刚开机时对所有项目做试剂空白测定， 试剂空白吸光度高（终点法）或者试剂空白吸光度变化率高（速率法） TBA（循环酶速率法）经常出现负值 蛋白项目、血脂项目结果偏高 胆红素（钒酸盐法）易出现异常值原因：比色杯划痕较深较多，清洗系统清洗不彻底,比色杯污染实验方法,以项目A对BCDE 4个项目比色杯污染,不同类型的交叉污染的发生几率由高到低排列：,试剂针携带污染,搅拌棒携带污染,比色杯污染,样本针携带污染,清洗系统携带污染,用排除法鉴别不同类型的交叉污染的排列顺序（在保证试剂质量没有任何问题的前提下）：,样本针携带污染,比色杯污染,试剂针携带污染,搅拌棒携带污染,清洗系统携带污染,试剂交
11、叉污染-类型,1. 试剂成分间的直接影响2.试剂成分间的间接影响3.反应进程相同4.影响反应条件,试剂交叉污染,1. 试剂成分间的直接影响前一个测定试剂中直接含有后一个测试试剂所要测定的项目。例如：通常在AMY的R1试剂中含有Ca离子（酶活化剂）,当某样品作AMY和Ca这两个检测项目时，检测的顺序是先检测AMY，接着检测Ca。因吸取过AMY的R1试剂针上可能沾有残留的R1试剂，所以当R1试剂针再吸取Ca试剂时，会引入AMY的R1试剂中含有的Ca离子，这样对Ca项目的检测结果就可能造成正误差,试剂交叉污染,常见试剂成分间的直接影响葡萄糖（GLU）（氧化酶法）、总蛋白 （TP）与酸性磷酸酶（ACP
12、）试剂中含有较高浓度的钾（K + ）；胆碱酯酶（ChE）、总胆固醇（CHOL）、GLU（GOD法）、尿酸（UA）（尿酸酶法）、乳酸脱氢酶（LD）（IFCC法）、羟丁酸脱氢酶 （HBDH）（DGKC法）等试剂中含有磷酸缓冲液；CHOL、TG试剂及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂中含有胆酸钠；丙氨酸氨基转移酶 （ALT）（IFCC法）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）（IFCC法）试剂中含有高活性的LD；以上试剂的交叉污染就分别会对、K+（紫外酶法）、磷（P）、总胆汁酸（TBA）及LD的测定结果造成干扰,试剂交叉污染,2.试剂成分间的间接影响试剂成分参与反 应：上一个试剂中含有的某种试剂成分与下一
13、反应所要测定的底物有作用，因而干扰下一反应的测定结果。如：Mg 2+测定试剂的络合 剂亦能与铁（Fe）结合，影响铁与铁络合剂的结合；直接胆红素（DBil）（重氮法）试剂含有EDTA，Mg 2+试剂中含有 EDTA，均能与Ca结合，从而影响Ca的测定；以甘油作为酶保护剂的试剂，会对TG的测定带来干扰；钙（MTB法）试剂对K+有 负干扰；CHOL试剂中含有胆固醇酯酶，可水解胆固醇酯形成游离胆固醇，而引起对游离胆固醇测定的干扰。,试剂交叉污染,（3）反应进程相同：上一个试剂所引导的反应对下 一个项目的反应进程带来间接的干扰，下一项目所测定的是前后两个项目反应的综合作用结果。如：当上一反应产物为H2O
14、2时，则对以Trinder反应产生 颜色的测定结果引起干扰，如UA对CHOL结果的影响，CHOL对肌酐（CREA）（酶法）测定结果的影响，GLU（氧化酶法）对CREA测定结果的影 响；CK（NAC法）、CK-MB（NAC法）试剂中含有GLU成分，其分析方法的原理中包含GLU的己糖激酶（HK）反应过程，因此可能对GLU的测定 带来干扰，尤其对GLU的HK法测定可能带来严重干扰。,试剂交叉污染,（4）影响反应条件：如上一试剂缓冲液成分改变了下一反应的pH环境，从而改变反应速率，如 TP（双缩脲法）测定需在pH89时，蛋白肽键才都能与碱性铜溶液作用生成紫色反应，若pH8时，则会导致TP结果偏低，还直
15、接影响球蛋白、白蛋白/ 球蛋白的结果；酶活性测定有最适pH，大多数酶反应pH在6.07.5之间，ALP、-GT、LDH则在碱性条件下最适宜；CREA（苦味酸速率法） 反应条件为碱性，果糖胺（动力学法）反应条件为酸性，受到污染后反应速率会减慢。CREA（酶法）试剂中含有抗坏血酸氧化酶，影响了氧化还原反应的进程， 会对TBA（酶循环法）测定结果有影响。DBil（钒酸盐氧化法）试剂中含有表面活性剂的酒石酸盐缓冲液会影响ALT活性，对测定结果有负干扰。,如何消除试剂间的化学污染,（1）为减少试剂间的化学污 染，应定期对仪器进行适当的保养，如更换管道，用去污剂、酸性洗液清洗比色杯，用去污剂擦清试剂针，用
16、无水乙醇擦洗搅拌棒等。（2）合理安排检测项目的顺 序：一般在安排项目顺序时要求两个项目间至少要有一个非干扰项目，由于各厂商试剂盒原理不同，内含成分不同，故无固定的测定顺序格式，需要自己摸索。较好 的做法是将被干扰项目置于干扰项目之前，以消除干扰发生的可能。一般检测顺序有以下原则：不受上一试剂的干扰；不影响下一试剂测定；不影响测试速 度；充分运用剩余试剂位开展新项目；利用好仪器的功能。（3）当合理设置测试顺序无法消除交叉污染时，可使用生化分析仪的试剂针、比色杯清洗程序，对 试剂针、比色杯进行2次或多次清洗。用碱性清洗液及酸性清洗液交叉冲洗试剂针可以有效地避免携带污染。（4）选用具有抗交叉污染的试
17、剂盒：如在游离胆固醇 试剂中添加胆固醇酯酶抑制剂，以减少胆固醇酯酶水解胆固醇酯而引起对游离胆固醇测定的污染。（5）部分大型全自动生化分析仪有多个模块或通道，可以将有化 学污染干扰的项目排在不同的模块或通道中检测。,第一类：前一测试项目试剂中含有紧跟其后测试项目所要测定的底物。此时残留的污染物被带入下一测试中，与该测试的试剂反应，可能会导致结果异常。引起这类交叉污染产生的物质明确，并且可以定量分析。主要项目有： 1. ALT(IFCC法),AST(IFCC法)含高活性的LDH,会影响其后的LDH结果。 2. CK-NAC、CK-MB-NAC酶偶联测定试剂含高浓度Glucose,会干扰其后的血糖测
18、定，尤其对HK法干扰严重。 3. Glu(GOD法)、UA(尿酸酶法)、a-HBDH、 TG、 Ca(偶氮胂III法)、 TC(CHOD- PAP)等均采用磷酸盐缓冲液,会干扰位于其后无机盐(P)的结果。 4. ALP(IFCC-AMP法)，CK-NAC,CK-MB-NAC,TG(GPO法)试剂均含高浓度Mg2+会影响紧随其后的Mg2+的结果。 5. TC、HDL-C、HDL-C、LDL-C采用胆固醇氧化酶法的试剂含胆酸钠，会干扰紧跟其后的TBA结果，致假性偏高。 6. 以对一硝基苯麦芽七糖苷法(4NP-G4)为底物的AMY试剂含Ca2+浓度高会影响其后测Ca2+的准确性。 7. TG，TC试
19、剂中有LIP，会导致LIP的测试结果不真实。 该种类型的交叉污染单试剂终点法的受污染项目测试结果的抬高或降低反映的是搅拌杆的携带污染。因为试剂针携带进来的上一个测试的干扰物会和下一个试剂发生反应，由于携带量小，一般在试剂空白段（2min）即反应平衡。而双试剂项目的测试结果反映的是试剂针和搅拌杆的综合污染。,第二类：前一测试项目试剂中的某种（些）成份干扰紧随其后测试项目所要测定的底物。引起这类交叉污染产生的物质明确，但和第一类不同的是，前一测试残留并带入下一测试的污染物并非待测物本身，而是能与待测物进行其他的反应或显色物质波段重叠或引起测试条件的变化如PH值改变等，从而带来对测试过程的干扰，这种
20、干扰作用不易进行定量分析。主要项目有： 1. TC、HDL-C、HDL-C、LDL-C最终反应都是过氧化氢和4-氨基安替比林在过氧化酶的作用下产生醌亚胺显色（505nm），因此这些项目间会相互干扰。 2. TP的检测原理是蛋白质与铜离子生成紫蓝色复合物，该显色物质在546nm有吸收峰，在波段500nm600nm都有较大吸收；因此TP试剂可能影响500nm -600nm波段的终点法显色测定（如TC，TG，UA等）。另外，TBIL（重氮法）和DBIL（重氮法）生成的偶氮物在546 nm 下有吸收峰，因此TBIL（重氮法）或D-BIL（重氮法）会和TP相互干扰。 3. ALB（BCG）检测原理是形成
21、的蓝绿色复合物在578nm有强吸收，且在整个500nm-700nm都有较强吸收，因此ALB试剂会干扰紧随其后的500nm-700nm波段的终点法显色测定（如UA等）。 4. ALT的R2（含NADH）及 CR的R2试剂（苦味酸，呈深黄色）在340nm有很强的吸收，会干扰紧随其后的340nm免疫比浊终点法的测定（如PA，CRP等），且免疫比浊法的终点吸光度越低干扰越严重。 该种类型的交叉污染无法分出是试剂针还是搅拌杆携带进的污染对测试结果的影响，是两者的综合影响。,四解决方案,1. 当交叉污染程度较轻时，设置防交叉污染清洗程序，增加对样本针、试剂针、比色杯的清洗次数。2 合理设置实验项目的排列顺
22、序，避免试剂交叉污染。ALT 、AST、 TBIL、 DBIL 、TBA、ALP、GGT 、CHE 、TP、 Alb、Urea、 UA 、Cr、 CK 、CK-MB、HBDH 、LD、 Glu 、TG 、TC、 HDL-C、 LDL-C、APOAI、APOB、 Amy 、CO2 、P 、 Fe、Ca、 Mg。 (仅供参考)3 当交叉污染程序较重时，应对仪器做大保养和维修，更换相应部件。4.每个实验项目所需的样本量、试剂量不要随意同比例降低，以保证反应液保持较大的缓冲能力。,设置特殊清洗程序,实验方法同确认实验，假设确认实验确认了A项目对B项目存在污染。在仪器中设置A项目 B项目进行特殊清洗。选
23、择特殊清洗液（仪器内部水，碱性清洗液，酸性清洗液）。一般先设置仪器内部水，设置清洗液量，可根据项目参数中的试剂液量输入。输入特殊清洗程序后，按A B1 B2 B3的测试顺序，进行清洗效果确认，考察B1 / B3的比值，确认是否达到清洗效果。,设置清洗程序,清洗效果确认,判定有污染 水清洗 污染污染消除 碱性清洗液 污染 污染消除 酸性清洗液 污染 污染消除 调整测试顺序等其他方法,五注意事项,1 当交叉污染较严重时，往往是几类污染同时存在。2 项目编排顺序要与试剂瓶安放顺序保持一致。试剂应尽量选用大容量瓶盛装。3 试剂针携带污染与搅拌棒携带污染的现象有很多共同点，鉴别较复杂。,污染 是检验工作中的麻烦制造者 (偶发性 ,无可预测性 ) 清洗程序设定过多 样本处理速度降低 不运用清洗程序 浪费仪器功能 通过污染实验,了解实际污染现状 ,运用 ,设定清洗程序 最大程度消除污染,最大程度保证处理速度,
