1、抗血管内皮生长因子多位点核酶的合成及其体外切割作用作者：谷仲平 王耀程 周勇安 李谨革 张涛 陈农安【关键词】 内皮生长因子Design and synthesis of vascular endothelial growth factor specific multi-site ribozyme and its cleaved activity in vitro【Abstract】 AIM: To design and synthesize a multisite ribozyme against VEGF165 and to investigate its cleaved activity
2、 in vitro. METHODS: Specific singlesite (Rz1, Rz2, Rz3) and multisite ribozymes (Rz123) against VEGF165 were designed by computer analysis of the secondary structure of the ribozyme and the target RNA flanking sequence around the cleavage sites. The transcriptional vector was constructed, which incl
3、uded the multisite ribozyme and 5, 3cis selfsplicing ribozymes. The cleavage activity of the multisite ribozyme on target RNA was observed. RESULTS: The multisite ribozyme was released properly from the transcription of the selfsplicing vector with cleavage by 5, 3cis ribozymes. The multisite ribozy
4、me cleaved the target RNA and increased the cleavage efficiency. The cleavage rate was (3710)% (Rz1), (518)% (Rz2 ), (6815)% (Rz3) and (8811)% (Rz123), respectively. CONCLUSION: The synthesized multisite ribozyme designed with computer can effectively cleave target RNA.【Keywords】 endothelium,vascula
5、r; endothelial growth factors; RNA,catalytic; cleavage; in vitro【摘要】目的： 设计合成血管内皮生长因子多位点核酶，探讨其对靶 RNA 的切割作用.方法： 利用计算机辅助设计针对 VEGF165 的 3 个单位点核酶 (Rz1, Rz2, Rz3) 和联合型多位点核酶 (Rz123)，构建其自剪切转录载体，观察多位点核酶对靶 RNA 的切割作用.结果： 构建的多位点核酶自剪切转录载体在体外转录中，顺式核酶发生了自身剪切，并释放出正确的目的核酶，多位点核酶可切割靶 RNA，且效率高于单一核酶，其切割效率分别为 (3710)% (Rz
6、1), (518)% (Rz2 ), (6815)% (Rz3) 和(8811)% (Rz123).结论： 抗血管内皮生长因子多位点核酶体外可联合切割靶 RNA，具有较高的生物活性.【关键词】 内皮，血管；内皮生长因子；RNA，催化；切割；体外研究0 引言肿瘤的生长、转移依赖于肿瘤血管的生成.肿瘤细胞不仅通过血管从宿主获得营养和排出代谢产物，而且通过肿瘤血管向宿主输入大量肿瘤细胞，导致肿瘤的不断生长和转移.血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有促血管形成、增高血管通透性和促进内皮细胞有丝分裂等多种功能，在肿瘤的生长转移中起关键性的
7、作用.抑制和阻断 VEGF 的表达，可以显著抑制多种肿瘤的生长和转移.抗血管生成治疗肿瘤具有高效低毒和不易产生耐药性等特点，已成为当今肿瘤研究的热点1-3.核酶（ribozyme, Rz）是能够序列特异性切割靶 RNA 的一类 RNA 分子，通过人工设计合成的特异性核酶分子即可阻断有害基因的表达.锤头状核酶分子较小、结构简单、人工设计容易，且在靶 RNA 中出现率高，因而被广泛用于基因治疗的研究4.本研究选择VEGF165 基因 mRNA 为靶分子，设计合成多位点锤头状核酶，构建核酶的自剪切转录载体，观察多位点核酶对 VEGF165 mRNA 的切割作用.1 材料和方法11 计算机设计核酶采用
8、中科院上海生化研究所陈农安研究员编制的核酶设计软件程序，确定 VEGF165 mRNA 上的核酶切点位置，根据Symons 的锤头状核酶结构模型，设计核酶的切割活性中心及其两侧的结合序列5 ，并采用加拿大国家科学院 Zuker 编写的 pcFOLD 软件对靶mRNA 切点两翼碱基序列二级结构进行分析预测，确定核酶的序列和切点位置.12 质粒、菌种及试剂质粒 pGEMRzHBV（含有 5和 3顺式自剪切核酶）及宿主菌 JM109 由第四军医大学唐都医院感染病科李谨革博士惠赠.pGEM3Zf（+）VEGF 质粒（含 VEGF165 基因全序列）由美国哥伦比亚大学 Abraham JA 教授惠赠.I
9、PTG、Xgal 和限制性内切酶购自华美公司，T4DNA 连接酶和 T7RNA 聚合酶为 Promega 公司产品，质粒纯化试剂盒和转录试剂盒为 Gibco 公司产品， 32PUTP 购自北京亚辉公司.13 合成核酶 3 个核酶基因均由大连宝生物技术有限公司合成.合成的核酶经 T4 多核苷酸激酶磷酸化、变性、退火，分别形成粘性末端（XbaI, Hind） ， （Hind, BamH）和（BamH, Aat）.14 设计构建核酶自剪切转录载体合成的 3 个核酶片段经 T4 连接酶连接，得到带有 Xba和 Aat黏性末端的片段.质粒 pGEMRzHBV 的 T7 启动子下游依次排列有 5 顺式核酶
10、、RzHBV 和 3 顺式核酶.经 Xba和Aat双酶切及 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳后，用质粒纯化试剂盒回收.用T4DNA 连接酶与上述核酶连接片段连接，构成核酶自剪切转录质粒pGEMRz123（Fig 1）.将其转化感受态 JM109 菌，经蓝白筛选阳性克隆菌落，抽提质粒，进行酶切分析和 DNA 测序鉴定.图 1pGEMRzVEGF 质粒的构建 略15 核酶体外转录及对靶 mRNA 的切割核酶 Rz123 分别经（Xba, Hind） ， （Hind,BamH）和（BamH, Aat）双酶切得到 Rz1，Rz2和 Rz3.重组质粒 pGEMRz123 和 pGEM3Zf（+）VEGF 经
11、内切酶酶切线性化后，用 T7 体外转录试剂盒合成 Rz123，Rz1，Rz2，Rz3 和底物 VEGF165 mRNA.将 Rz123，Rz1，Rz2，Rz3 和底物 RNA 按 101 比例混合，切割反应体系为 pH 76 的 75 mmol/L TrisHCl 和 6 mmol/L MgCl2，反应体积为 10 L反应 2 h 后用终止液 7 mmol/L Urea 和 20 mmol/L EDTA 终止反应， 60 g/L 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影确定切割条带位置，激光图像分析仪分析切割效率.以上每个反应重复 6 次.统计学处理： 统计分析采用 SPSS 软件进行方差分析，两两
12、之间采用最小显著差法.2 结果21 核酶的计算机设计根据计算机对其二级结构的分析，发现VEGF165 mRNA 上 108，189 和 249 3 个位点的二级结构较为理想，分别将切割这 3 个点的核酶命名为 Rz1，Rz2，Rz3.根据能量最低化原理预测核酶的切割效率为 Rz1 图 2pGEMRzVEGF 质粒的转录 略22 核酶的合成按照计算机辅助设计的结果，分别合成了带有黏性末端的 Rz1，Rz2，Rz3 基因，经酶切和测序鉴定，结果和设计的预期序列完全一致.其碱基序列如下：23 自剪切转录载体的构建及其体外转录 pGEMRz123 经 T7 RNA 转录试剂盒体外转录，产物放射自显影可
13、见 3 个条带，分别是 Rz123（134 nt） 、5 顺式核酶（64 nt）和 3 顺式核酶（54 nt） （Fig 2）.这表明设计合成的自剪切转录载体发生了 5和 3 顺式核酶的自剪切，同时释放出了目的核酶.pGEMRz123 经（Xba, Hind） ， （Hind, BamH）和（BamH, Aat）双酶切，体外转录分别得到 Rz1，Rz2 和Rz3，经测序分析结果正确.图 3 核酶 Rz1,Rz2,Rz3 和 Rz123 对靶 mRNA 的切割作用 略24 核酶对靶 RNA 的切割作用 Rz1，Rz2 和 Rz3 分别将 VEGF165 mRNA 切割成 110 nt 和 500
14、 nt、190 nt 和 420 nt、250 nt 和 360 nt 大小的两个片段；Rz123 与底物作用，除可得到 Rz1，Rz2 和 Rz3 单独切割底物所见的上述片段外，还可共同作用产生 80 nt 和 100 nt 的片段（Fig 3） ，同理论预测结果一致.对底物的切割效率分别为 Rz1(3710)%，Rz2(518)%，Rz3(6815)%，Rz123(8811)%，与计算机预测的一致.经方差分析 Rz123，Rz1，Rz2 和 Rz3 的切割效率存在显著差别（F=22.81，P=0000） ，Rz123 高于单独作用的核酶的切割效率(P005)，Rz1，Rz2 和 Rz3 的
15、切割效率两两间比较具有显著差异(P005).3 讨论核酶由于具有诸多优点，作为抗肿瘤基因治疗的重要策略之一，已引起人们的重视.核酶切割靶 RNA 效率的高低主要取决于切点的选择和核酶的自身设计.理想的切点应符合 位于靶基因的重要生物功能区，以使该基因被切割后其相应的功能丧失. 靶点及其周围序列具有高度保守性，使核酶的切割谱更广泛. 靶点附近的二级结构应使核酶易于接近. 核酶两侧的无关附加序列应较短6.然而，核酶切点的选择、核酶催化活性中心及其两侧碱基序列长度的确立和核酶表达质粒的设计，很大程度上依赖于研究者的经验.目前切点的选择和核酶的设计有多种方法，计算机辅助设计核酶是一种常用、经济、方便和
16、有效的方法，但它依赖于计算机软件的功能.我们采用的软件是经过实践不断修改而成的.本研究利用此软件设计合成的抗 VEGF165 多位点核酶，体外转录后能够高效定点切割靶 RNA，表明我们的设计是正确的，计算机设计核酶是可靠有效的.核酶切割活性的发挥有赖于其空间结构的正确性.由于目前使用的核酶载体在转录和导入细胞后产生的核酶，其两侧的长片段附加序列（载体碱基序列）会阻碍核酶与靶 RNA 结合，同时核酶发挥作用后不能很快与靶 RNA 解离，影响了核酶的切割效率，而且长片段附加序列的合成增加了细胞 RNA 的合成量，对细胞的正常代谢存在一定的影响.因此我们引入了 5 cis 和 3 cis 自剪切核酶
17、，实验结果证实有效地去除了附加序列对核酶活性的影响7,8.研究发现由于存在靶 RNA 分子基因碱基突变、空间结构的多样性以及核酶同细胞内蛋白质因子结合的可能性，从而使一些单一核酶丧失切割靶 RNA 的活性.因此仅提高单一核酶的分子拷贝数，并不能有效地提高其在细胞内的切割活性.而多位点核酶可在某个单一核酶不能切割靶分子时，其他核酶仍有机会切割靶 RNA，从而使其失去生物功能.在本研究中，不仅抗 VEGF165 多位点核酶中的单一核酶能够独自发挥作用，而且能够互相协同、互相促进而联合发挥作用.说明多位点核酶比单一核酶更有效.利用核酶抗血管生成治疗肿瘤具有广阔的应用前景.本研究采用多位点核酶可定点高
18、效地切割 VEGF165 mRNA，为细胞内及在体应用核酶抗肿瘤血管生成奠定了基础.【参考文献】1 Gu ZP, Wang YJ, Li JG, et al. VEGF165 antisense RNA suppresses oncogenic properties of human esophageal squamous cell carcinoma J. World J Gastroenterol, 2002;8(1):44-48. 2 Perrone G, Vincenzi B, Santini D, et al. Correlation of p53 and bcl2 expressi
19、on with vascular endothelial growth factor (VEGF), microvessel density (MVD) and clinicopathological features in colon cancer. Cancer Lett, 2004 ;208(2):227-234.3 谷仲平. 血管内皮生长因子与肺癌 J. 国外医学外科学分册, 2002;29(4):232234.Gu ZP. Vascular endothelial growth factor and lung cancer J. Foreign Med Sci Sect Surg,
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21、rhead ribozyme J. Acat Biochim Biophys Sin, 1996;28(3):279-285.6 谷仲平. 血管内皮生长因子与肺癌. 核酶在肺癌基因治疗中的应用 J. 国外医学呼吸系统分册, 2003;23(3):141-143.Gu ZP. Application of ribozyme in lung cancer gene therapy J. Foreign Med Scien Sect Respir System, 2003;23(3):141-143.7 Gu ZP, Wang YJ, Wu Y, et al. Synthesis of ribozy
22、me against vascular endothelial growth factor(165) and its biological activity in vitroJ.World J Gastroenterol, 2004 ;10(10):1495-1498.8 谷仲平, 王云杰, 李谨革, 等. 血管内皮生长因子 165 核酶的合成及其体外活性 J.第四军医大学学报, 2002; 23(3):272-274.Gu ZP, Wang YJ, Li JG, et al. Synthesis of vascular endothelial growth factor 165 ribozyme and its biological activity in vitro J. J Fourth Mil Med Univ,2002;23(3):272-274.
