1、老龄大鼠对外周不同化学组织损伤的痛行为反应特点作者：葛伟 陈军 李源 陈会生 【关键词】 热痛敏 关键词: 老龄大鼠;持续性自发痛;机械性痛敏;热痛敏;蜜蜂毒试验;甲醛试验 摘 要:目的 观察老龄大鼠对一侧足底 sc 蜜蜂毒液（BV）或甲醛（F）诱致外周化学组织损伤的痛行为特点. 方法 应用持续自发缩足反射（PSFR） 、热刺激缩足反射潜伏期（PWTL）和机械刺激缩足反射阈值（PWMT）痛反应定量检测方法，对老龄大鼠持续性自发痛和痛敏特点进行时程观察. 结果 老龄鼠的基础 PWTL 和 PWMT 均较青年成龄鼠高;老龄大鼠一侧足底 sc BV 或 F 后也可引起 PSFR，但与青年成龄动物相比
2、BV 诱致的 PSFR 数显著增多，但达到高峰的时间延迟 30min，且反应时程大致相同.F 诱致的 PS-FR 在反应形式和时程上都与青年成龄动物无显著差别，但是第二相 PSFR 数显著减少;老龄大鼠一侧足底 sc F 不引起损伤部位 PWTL 缩短和 PWMT 降低，相反 PWTL 和 PWMT 显著增高以至对很强刺激无反应;但是，老龄大鼠一侧足底皮下注入 BV 却可引起损伤部位PWTL 和 PWMT 显著缩短或降低，初步时程观察发现 BV 诱致的热和机械性痛敏可持续数日以上，且后者的时程远长于前者. 结论 老龄大鼠热和机械痛阈均较青年成龄大鼠高;外周组织损伤时，老龄大鼠持续性自发痛行为反
3、应根据不同模型具有不同反应形式，但是总体表现为反应缓慢，强度弱;sc BV 诱致外周组织损伤时，老龄大鼠有显著的原发性热和机械性痛敏，但是 sc 甲醛后却不引起原发性痛敏，反而出现热和机械刺激反应缺失，提示两种痛模型在老龄也具有不同的发生机制. Keywords:elderly rat;persistent spontaneous pain;mechan-ical hyperalgesia;heat hyperalgesia;bee venom test;formalin test Abstract:AIM To observe pain-related response character-
4、istics of elderly rats to peripheral chemical tissue injury in-duced by subcutaneous intraplantar injection with bee venom solution（BV）or formalin（F）.METHODS By using quan-titative measurements for persistent spontaneous paw flinch-ing reflex（PSFR） ，paw withdrawal thermal latency（PWTL）and paw withdr
5、awal mechanical threshold（PWMT） ，time course and response characteristics of the persistent spontaneous pain and hyperalgesia of elderly and adult young rats were compared.RESULTS The elderly rats showed a significant increase in both PWTL and PWMT compared with the adult young rats.The elderly rats
6、 re-ceiving s.c.BV or F could also express PSFR，however，the total number of the BV-induced PSFR was significantly in-creased and the peak response was delayed about30min after injection when compared with adult young rats.The response pattern and time course of the F-induced PSFR in elderly rats wer
7、e similar to those of adult young rats，however，the num-ber of PSFR in F phase2response was significantly decreased in elderly rats.Intraplantar F injection in elderly rats was not able to induce decrease in PWTL and PWMT，reversely，it resulted in an increase in PWTL and PWMT or loss of sen-sory respo
8、nse to high intensity stimuli.Intraplantar BV injection in elderly rats，however，was able to induce de-crease in both PWTL and PWMT in the injured region lasting for several days and the duration for PWMT was significant longer than that for PWTL.CONCLUSION The heat and mechanical pain threshold in e
9、lderly rats are higher than those of adult young rats;The persistent spontaneous pain-related behavioral response in elderly rats is likely to be different in different pain models of tissue injury and the acute pain response is generally slower and weaker than that in adult young rats;The elderly r
10、ats show dramatic pri-mary heat and mechanical hyperalgesia following peripheral tissue injury by s.c.BV injection，however，the same treat-ment with F fails to produce either heat or mechanical hype-ralgesia，but causes a loss of heat and mechanical response，suggesting a difference in underlying mecha
11、nisms of the two pain models. 0 引言 近几年的研究显示人体实验性痛、临床急性和慢性病理痛都随年龄的变化而异，因此要求疼痛的治疗也应该具有相应的对策1 .但是，因为当前对疼痛年龄变化的特点和发生机制了解甚少，治疗上仍无相应对策.实验发现随着年龄增长，人的痛阈增高、痛耐受性降低以及对伤害性阈上刺激的辨别能力下降1，2 .当前对这些疼痛年龄变化特点的神经生物学机制尚无任何实验证据，原因是缺乏系统而深入的动物实验和模型.本研究的目的是应用两种比较成熟的动物病理痛模型 蜜蜂毒试验3-8 和甲醛试验9，10 对老龄和青年成龄大鼠基础热和机械刺激痛反射阈值、外周不同化学组织损
12、伤诱致的持续性自发痛、原发性热和机械性痛敏的行为特点进行比较分析，以此为进一步研究这些行为特点的神经生物学基础提供实验模型. 1 材料和方法 1.1 材料 健康自然饲养老龄（大于 20mo 龄）雄性 SD 大鼠 20 只（西安交通大学医学院实验动物中心） ，体质量 500600g;健康青年成龄雄性 SD 大鼠 20 只（第四军医大学实验动物中心） ，体质量 180220g.实验过程中每只动物单独饲于塑料盒中，室温 2226，为了保持动物昼夜生物节律，实验室每日 8:0020:00 开灯，20:008:00 熄灯，行为学实验均在 9:0018:30 之间进行.实验前 5d 每日将大鼠置于实验观察
13、箱中 30min，使之适应.本实验是严格按照 IASP 关于应用清醒动物进行疼痛实验研究纲要的要求来实施和完成的11 .将老龄大鼠随机分为2 组:实验组 1:左足底 sc 蜜峰毒液（bee venom，BV）组（n=10）;实验组 2:左足底 sc 甲醛（Formalin，F）组（n=10）.将成年大鼠也随机分为2 组作为对照:对照组 1:左足底 sc BV 组（n=10）;对照组 2:左足底 sc F组（n=10）. 所用 BV 溶液是将粗制冻干蜜蜂毒素（美国 Sig-ma 公司）溶于 9g L-1 生理盐水制成，采用质量浓度 为 4g L -1 ，体积为 50L3-8 .F 溶液是用 9g
14、 L-1 生理盐水溶解化学纯多聚甲醛配制 9.25g L-1 溶液，配制成浓度 25mL L-1 的溶液，体积 50L.测痛的实验器材为 RTY-3 型自动热刺激仪（西安峰岚仪器厂）及 von-Frey纤毛机械刺激器（刺激强度由大到小依次为:150，120，90，60，45，39.5，37，36，30，26.5，19，12，9.5，8.0，5.8，3.7，1.7，1.0，0.6 和 0.3g）. 1.2 方法 1.2.1 BV 与 F 致痛模型的建立 根据本实验室以往的报道3，5，6 ，实验者轻轻地固定大鼠，用 26G5/8 皮针连接 1mL 注射器，尽快地将 50L 的 BV 或 F 注入其
15、左后肢足底中心皮下，注入后立即定量观察动物自发性痛反射行为（5min 自发缩足反射次数）.致痛剂注射前或 2h 后用辐射热刺激仪或 von-Frey 机械刺激器测试注射侧足底热刺激缩足反射潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）和机械刺激缩足反射阈值（paw withdrawal mechanical thre-shold，PWMT）.BV 或 F 注射完毕后，分别对持续自发痛缩足反射、PWTL 和 PWMT 的变化程度与时程（给药后 2，4，8，24，48，72 及 96h）进行定量评价. 1.2.2 PWTL 评价法3-5 将大鼠置于一底部为 2mm
16、 厚玻璃板的20cm20cm25cm 的透明有机玻璃箱中，并放置于高于实验台 30cm 的架子上以便观察，待测大鼠于箱中适应 30min 以上，使之从不安到逐渐安静下来.应用 RTY-3 型辐射热刺激仪，内装 100W 卤素投射灯，调节电压至 10V，调节灯源与玻璃板之间的距离，使落在足底的照射光圈直径为5mm，记录从照射开始至出现缩足逃避反射时间（s） ，此即为 PWTL;重复测量 35 次，同一部位间隔 10min，不同部位间隔 5min，取 PWTL 平均值.如果大于 40s 大鼠仍无反应则停止照射，以免导致足底组织热损伤. 1.2.3 PWMT 评价法3-5 以不同粗细和长度的尼龙丝制
17、成 17 个刺激强度不同（0.345g）的 von-Frey 机械刺激器.将一20cm20cm25cm 的透明有机玻璃箱放置于顶部为铁丝网高 30cm 的架子上，实验者手持 von-Frey 纤维穿过铁丝网格分别刺激大鼠两侧足底中心部位，刺激由小到大，每个强度反复刺激 10 次（次-次间隔 35s） ，将出现缩足反射 5 次左右的强度定为 PWMT. 统计学处理:实验结果以 x s 表示，应用方差分析（ANOVA Fishers PLSD）做统计学处理. 2 结果 2.1 基础 PWTL 和 PWMT 老龄鼠的基础 PWTL 和 PWMT 分别为（17.912.29）s 和（67.2910.7
18、4）g，而青年成龄鼠的基础 PWTL 和PWMT 分别为（11.951.03）s 和（30.827.13）g，两组经统计学比较具有显著差别（每组 n=20，P0.01）. 2.2 持续自发痛反应 用 BV 和 F 两种持续自发痛模型进行检测，结果显示老龄鼠持续自发痛反应与成龄鼠有一定区别.与青年成龄鼠相比，sc BV 后老龄鼠注射侧每 5min 自发缩足反射平均次数显著增加（43.756.26vs31.943.04，每组 n=10，P0.01） ，持续时程约12h，但不同的是反射次数在 BV 注射即刻较青龄鼠少，尔后逐渐增多，且达到峰值时间延迟了 30min.老龄鼠与青年成龄鼠在 F 第 1
19、相持续自发痛反应期（010min）无显著差别，但是在第 2 相反应期（1150min）前组显著少于后组（37.366.73vs58.386.85，每组n=10，P0.01）.老龄鼠在 F 反应模型中时程和形式无变化. 2.3 BV 诱致原发性热痛敏与机械痛敏 与成龄鼠相似，老龄鼠足底sc BV 后也可导致注射侧后足底 PWTL 和 PWMT 显著降低，与基础值相比下降了 50%60%.时程观察发现 PWTL 降低可持续 824h，但和 PWMT 降低持续 7296h 以上. 2.4 F 诱致热刺激和机械刺激反应 老龄鼠足底 sc F 后，注射处PWTL 和 PWMT 均升高，甚至反应消失. 3
20、 讨论 本研究首次对老龄和青年成龄大鼠对外周不同化学组织损伤诱致的持续性自发痛、原发性热和机械性痛敏的行为特点进行了比较分析，发现:与青年成龄大鼠相似3-6，9，10 ，老龄大鼠对外周 sc BV 或F 所诱致的化学组织损伤具有不同的持续自发痛行为反应形式，BV 和 F均可诱致持续自发缩足反射行为，但是前者的反应形式为单相性，而后者的反应形式为双相性，提示两个持续痛反应模型的反应形式无显著年龄差别;但是，老龄大鼠持续自发痛行为反应的高峰时间和强度（自发缩足频数）与青年成龄大鼠存在显著年龄差别，而且具有模型间的差异.如与青年成龄大鼠相比，老龄大鼠一侧足底 sc BV 后诱致的自发缩足反射次数达到
21、高峰的时间显著延迟 30min 左右，反应次数随时程逐渐显著增多.但是，F 诱致的自发缩足反射第一相和第二相均无显著时间延迟，第一相反射频数也无年龄差异;但第二相自发缩足反射数减少，具有显著年龄差异.这个结果提示外周不同化学组织损伤所诱致的持续自发痛反射行为具有年龄差异，而且在老龄动物两种痛模型所表现出 来的最强痛反应发生时间和强度都不相同，建议研究痛的年龄变化必须同时用多种痛模型比较研究才可能得出可靠的实验结果和结论;与青年成龄大鼠相似3，5，6 ，老龄大鼠对外周不同化学组织损伤所诱致的刺激诱发痛敏感性改变不同，如老龄大鼠一侧足底 sc F 不引起损伤部位 PWTL 缩短和 PWMT 降低，
22、相反 PWTL 和 PWMT 显著增高以至对很强刺激无反应，提示F 导致了外周组织感受器的灭活或损伤;但是老龄大鼠一侧足底 sc BV 却可引起损伤部位 PWTL 和 PWMT 显著缩短或降低，且时程可持续数日以上，提示 BV 可诱发原发性热和机械痛敏或触诱发痛（Allodynia）;与青年成龄大鼠不同，老龄大鼠原发性热痛敏和机械痛敏的时程不同，后者远长于前者，提示原发性机械痛敏和触诱发痛具有年龄差异且老龄动物更易慢性化;老龄大鼠基础热和机械痛阈均较青年成龄大鼠高，这个结果与人的实验结果相似1 ;从年龄变化的结果基本一致性来看，BV和 F 两种痛模型在老龄和青年成龄大鼠的表现均不同，强烈提示痛
23、模型间存在差异性和发生机制的多样性，这与我们以往发现的结果完全一致8 . 关于年龄因素对痛反应和痛感受的影响，已有一些人和动物的实验报道.年龄增长对躯体感觉皮质诱发电位传导速度有显著影响12 ，老龄人对皮肤辣椒素刺激诱发自发痛出现的报告时间也较青年成人延迟12s 左右13 ，老龄鼠热板试验潜伏期显著延长14 ，此外动物实验结果还显示外周神经纤维可随年龄增长脱髓鞘，同时髓鞘蛋白基因下调15 ，这些结果似乎可以解释为什么大鼠年龄增长伴随基础热和机械痛阈增高以及对外周组织损伤诱发的自发痛感知的潜伏期延长的原因. 年龄因素对自发痛反应和痛敏的影响已在 F 试验2 、辣椒素模型13 和坐骨神经结扎损伤模
24、型16 的研究中得到报道.已报道的 F 试验显示，F 的自发痛反应（用 4 级负重法评价）在青年成龄（3mo）和老龄大鼠（24mo）弱，而在中年成龄大鼠（18mo）最强2 ，反应形式和时程大致相同.这与本研究使用的自发缩足次数评价方法的结果基本相似.但是我们应用的 BV 模型的结果却与 F 试验结果不同，所以大鼠不同年龄变化对 BV 诱致自发痛反应的影响还需进一步分时间段观察.辣椒素模型人的研究结果显示老龄和青年被试者的自发痛感觉强度、皮肤红晕和热痛敏的面积均无显著差别，但是老龄被试者机械痛敏区的面积显著增大、机械痛阈显著下降、机械痛敏时程显著延长，但是热痛敏无年龄差别13 .坐骨神经结扎损伤
25、模型老龄痛也主要表现为触刺激诱发痛增强16 .这些结果与本研究 BV 诱致的原发性热和机械性痛敏的特点极其相似.但是辣椒素诱致的热痛敏在 1h 后消失，机械性痛敏在 3h 后消失，而本实验 BV 诱致的热痛敏可持续 824h，机械性痛敏的时程可持续数日，所以提示 BV 模型在研究老龄外周组织损伤炎症痛敏的发生和慢性化机制中更有价值.老龄大鼠和人机械痛敏范围大、时程较长的发生机制不清，但是很可能与外周感受器和脊髓中枢敏化双重机制有关8 .实验证据显示口周 sc F 可使老龄大鼠延髓三叉神经脊束核浅层 c-Fos 蛋白表达显著增多，而且前后神经轴的长度增加17 .神经化学和免疫组织化学染色的结果显示脊髓内源下行痛抑制系统的 5-HT 和去甲肾上腺素能纤维显著减少
