1、老年性痴呆动物模型的研究进展【关键词】 老年性痴呆；动物模型老年性痴呆又称阿耳茨海默病（Alzheimers disease，AD） ，是一种严重危害中老年人身心健康的神经系统退行性疾病，其临床表现为进行性记忆力减退和智力下降，主要神经病理特征是大脑皮质萎缩、神经细胞丧失，细胞外存在大量由 淀粉样蛋白（amyloid ；A）组成的老年斑（Senile Plaques；SP） 、神经细胞内神经纤维丝缠结（Neurofibrillary tangles；NFTs）以及皮质动脉和小动脉的血管淀粉样变性。因 AD病因病理的多样性、异质性和复杂性使建立理想的 AD动物模型面临巨大的困难和挑战，但近年 A
2、D研究者采用各种方法开展 AD模型的研制与应用，取得了一定成果，特别是 AD转基因动物模型应用成就更是令人瞩目，本文就 AD模型作一综述。衰老动物模型 自然衰老鼠的形态学观察可见鼠脑隔区、斜角带核及 Meynert基底核中的神经元萎缩、丧失，同时表现有感觉、运动及学习记忆等多种功能的下降，这些改变与人类 AD有相似之处。自 Takeda T首次报道快速老化小鼠（Senescence accelerated mouse/prone,SAMP）后，快速老化小鼠作为一个较理想的衰老模型目前已在许多国家广泛应用，其中SAMP8(prone/8)亚系既有自然衰老小鼠的特征，又有类似老年性痴呆的脑部病理及
3、学习记忆功能衰退。与 AD相关基因如载脂蛋白 E,糖皮质激素a受体及盐皮质受体 mRNAs水平在 SAMP8海马中较 SAMR1（快速老化小鼠的另一亚系）海马明显降低，而 bcl2a,PS2 和 tau mRNA水平却有显著意义的增高。这些结果表明在 AD病人脑中一些异常基因表达也在SAMP8中存在。在 AD病人中发现胰岛素脑脊液/血浆比率降低曾被认为是脑糖代谢紊乱的机制，而通过对 SAMP8研究证实，脑血管屏障完整性或对胰岛素转运能力的变化并非 SAMP8鼠学习和记忆下降的基础。KumarVB 等1研究小组证实，反义磷酸硫解酶低聚核苷酸（AO）能够降低 SAMP8脑内自然过表达的 APP及逆
4、转其学习及记忆的下降。SAMP8成功培育后，逐渐在众多 AD模型中占据重要地位，在国外已被广泛应用于阐明学习记忆功能及学习记忆功能障碍的基本机制,评价干预老化关联的疾病和改善学习记忆机能药物，但国内因 SAMP8鼠来源多有不便，相关研究开展较少。单因素损伤致 AD动物模型 早期主要用化学物质如大田软海绵酸（okadaic acid） 、AlCl3、海人藻酸（kainic acid）以及 淀粉样蛋白等进行脑室或核团内注射，使之出现 AD的病理典型表现（NFTs 及 SP）和学习功能障碍，大致可分为两类：1.与 tau蛋白过度磷酸化有关的损伤模型 Okadaic acid (OA)是一种丝氨酸/苏
5、氨酸蛋白磷酸酯酶(1A 和 2A)的特异性抑制剂。Nelson 等2将 OA注入成龄绵羊大脑，3 月后在注射部位及其周围呈现神经细胞内神经纤维丝缠结（NFT） ，OA 大鼠侧脑室注射6周后免疫组化分析可见 NFT样磷酸化 Tau蛋白和 A 淀粉样沉积斑块，而长期脑室投递可引起动物的记忆严重缺失。OA 诱导的神经退行性变性和 tao 蛋白的磷酸化及氧化损伤有关。通过注入海人藻酸损毁 nbM获得出现几乎所有的 AD样行为学及病理学变化，典型的老年斑（SP）广泛见于皮层区域，tao 蛋白样神经元在扣带回，海马 CA2区及下托和顶叶远高于正常组。但似乎并未见有神经细胞内神经纤维丝缠结的证据。而Mura
6、yamaH 等3认为聚集的 AL和 PDH tau蛋白磷酸化表面抗原决定簇结合并屏蔽，且能直接和 PHF tao 蛋白结合，即在 AD脑的神经纤维退行性变性中，出现 AL与 PFH tau 蛋白直接和磷酸化依赖地交互作用。利用小鼠脑室内注射 AlCl3、长期腹腔内连续注射或口服铝溶液获得出现AD病人 NFT病理改变的动物模型，成为研究铝与 AD关系有效工具之一。而在铝矿区内长期高铝暴露是老年人群认知能力下降不利因素4 ，利用慢性铝中毒制作 AD模型，可用于研究环境高铝暴露与 AD关系。2.与 A 沉积相关动物模型 淀粉样蛋白（AP ）是 AD病人老年斑的核心部分，利用 AP选择性损毁与 AD的
7、病变密切相关的胆碱能神经元集中部位如海马、前脑Meynert基底核等，制作的 AD模型一度成为研究 AD 的主要工具。 Giovannelli等5报道于脑内注射 AP 制作 AD模型，给大鼠脑基底核注射 A140 和 A2535 淀粉样多肽，可观察到注射部位有刚果红染色物质聚集，CHAT 活性降低及基底核胆碱能神经元减少，海马胶质细胞反应性增生，皮质和海马神经元数量较对照组明显减少，神经元退化，刚果红染色血管呈阳性，银染提示有神经纤维丝状物。采用同样方法在海马内注射 A2535，发现海马 NOS阳性神经元减少，并出现 NOS阳性星形胶质细胞，大鼠出现学习记忆能力下降6 。隔核内注射AP 未见有
8、类似病理变化，且大鼠的分辨学习能力没有明显改变，Urani等7采用脑室内连续 14 d单纯注射 A140，避免脑组织的急性损伤，未能获得 NFT等 AD特征性的病理改变。尽管这些研究结果不一致，可能与使用的剂量和注射的部位有关，但脑内注入 A 损毁胆碱能神经元集中的部位，诱导建立 AD动物模型，仍不失为一类较为接近 AD病人病理实际变化动物模型。单因素损伤模型只能模拟较少部分 AD病理变化的局限性，使得其在 AD应用中逐渐被日益成熟的多因素损伤模型和蓬勃发展的转基因动物模型替代。多因素损伤复合动物模型 1.双因素联用诱导的 AD模型 A 与 D 半乳糖（Dgal ）联合诱导的 AD模型。在腹腔
9、注射 Dgal的基础上,海马内注射 A 可导致大鼠的学习记忆减退, 出现 A 沉积、神经元死亡、胶质细胞浸润等8 ，同时可导致神经元丢失以及海马 CAl区线粒体结构损伤。该模型集衰老、A 沉积和记忆功能损害等 AD主要病理学改变，国内应用较为广泛。氯化铝与 Dgal 联合诱导的 AD模型。采用腹腔注射 D 半乳糖和 AlCl3灌胃合并制备 AD模型,模型组小鼠出现了胆碱能神经元及其他神经元不同程度的丢失,学习记忆能力减退,脑组织出现 A 沉积并有类 SP和 NFT形成,较成功地模拟了 AD的发病及病理特征。造模后发现模型小鼠脑内海马部位 APP基因表达水平显著提高，刚果红染色结果显示,海马 S
10、P的数量明显增加9 。该模型集铝中毒、衰老、A 沉积、NFT 形成和记忆功能损害于一身，造模方法简单,造价低廉,适合大规模药物筛选。Wortmannin 和 GF109203X 联用损害模型。王建枝10同时在大鼠侧脑室或双侧海马注射 wortmannin(磷脂酰肌醇3激酶抑制剂)和 GF109203X( 蛋白激酶 C抑制剂),大鼠出现明显行为学障碍,海马 GSK3 酶活性增加到原来的 3.7倍， Tau蛋白一些特殊位点磷酸化明显增强,并出现 NFT样病理变化，而骨架蛋白 Tau的特殊位点的磷酸化程度与动物的学习、记忆障碍正相关,即 Tau蛋白过度磷酸化程度越高,大鼠学习记忆能力越差。该类模型可
11、用于筛选针对蛋白激酶过度激活引发的 Tau蛋白 AD样异常过度磷酸化、NFT 样病理变化及学习、记忆障碍的 AD治疗药物,还可用于研究蛋白激酶和 AD发病机制之间的内在关系。其他双因素联用损伤 AD模型。主要采用 Dgal 致衰老结合胆碱能神经系统损伤或 A 诱导等其他因素制作 AD模型，如喹啉酸(QA)与Dgal 联合诱导的 AD模型，利用兴奋性氨基酸受体激动剂 QA海马内注射破坏海马胆碱能神经元，也有用具有神经毒作用的鹅膏蕈(ibotenic acid,IBO) 脑内注射结合大鼠腹腔注射 Dgal 方式或将 A40 和小剂量的 IBO共同注入大鼠海马制作 AD模型，这些模型均能较好的模拟出
12、类似AD的部分病理变化，是国内研究 AD常用模型。双因素联用损伤 AD模型在临床上不仅有记忆功能的损害，同时兼见衰老表现，较好的模拟了 AD的主要病理学改变，而动物自愈倾向和自愈时限的研究未见报告, 建立稳定性、重复性更好的模型有待进一步深入研究。2.三因素联用损伤致 AD模型 东莨菪碱(SCOP)、AlCl3 与Dgal 联合诱导的 AD模型。研究者在每日 Dgal 腹腔注射和胃饲AlCl3水溶液连续 4周的基础上于实验观察前腹腔注射 SCOP诱导 AD模型，拟建立集衰老、铝中毒以及胆碱能系统损害为一体的三因素 AD动物模型。该模型学习记忆能力显著下降,且其记忆损害程度依次为:SCOP+Al
13、Cl3+Dgal 组Dgal+ 胃饲 AlCl3组Dgal+ 注射 SCOP组。IBO、Dgal 联合与 A140 诱导的 AD模型。大鼠皮下注射 Dgal 56 d的基础上于 Meynert 基底核一次性注射 IBO和左侧脑室连续 7 d注射 A140 诱导 AD模型，模型鼠出现记忆障碍,海马皮层锥体细胞数量明显减少,但未见 NFT和 SP等病理改变,推测可能与脑室作用时间及剂量有关。也有学者在大鼠腹腔内连续注射 Dgal 6周后再于双侧海马内分别注射 A 和 IBO诱导 AD模型, 三种药物联用采用不同注射方式，均较成功模拟了集衰老、A 沉积以及胆碱能系统损害为一体的类似 AD病理变化，较
14、双因素损伤模型更能体现疾病的复杂性和病变的广泛性，但也存在注射部位不规范、注射剂量不一致等不统一之处，有待大样本模型验证研究。A140 、AlCl3 与重组人类转化生长因子 1(TGF1)联合诱导的 AD模型 在较早期 Frautschy等 11设计 A140 加TGF1 双因素两位点注射的大鼠模型,在一个位点,即脑室内注射溶解的A(140), 远离前一位点的另一位点注射可促进沉积的不同药物, 避免注射位点附近大量 A 聚集和复杂的注射损伤的影响。研究证实 TGF1和 A140 注射后可出现大量弥散性 A 沉积。国内学者于大鼠侧脑室内连续 14 d注入 A140 。连续 5 d注入 1%氯化铝
15、溶液，首次注射时在丘脑前背侧核注入 IOngTGF1，模型鼠不但出现大量淀粉样蛋白沉积、ChAT活性降低，且在 3个月后出现 AD特征性的 SP和 NFT，此模型的这些特点都弥补了单因素铝中毒模型的不足。三因素损伤模型近年开展日渐增多，笔者认为过多的损伤因素不仅加重动物的病理负担，而且加大制作模型的难度，模型动物存活率低，模型的稳定性和可重复性必定受到不同程度影响，因此结合实验研究目的适当选择双因素损伤模型更为合理，如研究环境铝暴露与 AD关系可选用大鼠长期口服铝液结合 A 海马注射制作 AD模型，不仅缩短造模时间，避免单一铝中毒造模时间过长，又能更为接近环境高铝暴露下实际状况。结合铝与 ta
16、u蛋白磷酸化密切关系及 A 毒性制作的双因素损伤 AD模型更具有现实意义。在国内大多数实验室不具备开展转基因动物模型条件下，多因素损伤模型将是研究AD的主要选择。转基因动物模型 1.转 APP基因鼠 最早于 1991年首次报道成功将淀粉样蛋白前体(beta amyloid precursor proteins, APP)基因转入小鼠后，AD 转基因动物模型成为 AD研究热点。PDAPP 小鼠。Games等第 1次报道转人类 APP695swe和 APP717VF 突变的 PDAPP鼠，它是由 C57BL/6鼠与 DBA/2F1鼠交配产生。研究发现转入人类突变的 APP基因小鼠有 APP高水平的
17、表达，并于 69 月时在海马、胼胝体及大脑皮层出现细胞外大量的 AP 沉积、神经炎斑块、突触丧失和小胶质细胞增生等类似 AD的病理特征，但未见形成 NFT。转入人突变型 APP基因并表现 A 沉积的小鼠转基因模型,标志着 AD转基因动物模型研究进入了新阶段。而 Dave M12用 AP 疫苗免疫转基因鼠能够显著的减少淀粉样沉淀及减轻记忆力下降，支持 AP 作为 AD中心角色的假说，转PDAPP基因鼠为研究 AD带来新的突破，使得 AD研究得到前所未有的高度。Tg2576 小鼠。Hsiao 等13申请了专利的转基因鼠。Tg2576 小鼠是转人类 APP695基因小鼠,存在 2个位点突变:670
18、位赖氨酸突变成天门冬酰胺和 671位蛋氨酸突变成亮氨酸。该小鼠在 912 个月时出现 SP，随着 A 量的增多,A 沉积逐渐出现在额叶、颞叶、内嗅皮质、海马、海马回钩前部、海马回和小脑，其行为学改变有学习和记忆损伤等。Tg2576小鼠成功研制使其成为研究 AD的提速工具，得到广泛应用。APP23 小鼠。将人类 APP695基因通过仓鼠由转人类 APP695鼠和 APP V717I鼠交配得来的 APP23小鼠，比正常小鼠脑内多 7倍的 APP。在 6个月时已有 A 沉积，到 24个月时大量出现在皮质和海马,同时出现炎性反应:神经炎、突触损伤及 tau过度磷酸化，A 沉积随着年龄增长出现数量和体积
19、增多。大脑淀粉样血管病更加区域化，在脑脊液中出现更多可溶性 A,SP 比 AD脑中的斑点可溶性更高。空间记忆障碍开始出现在3个月时,并进行性加重14 。TGCRND8 小鼠。由转人类 APP695鼠和APP V717F鼠交配得来的 TGCRND8小鼠,表达 2个突变人类家族性ADPS1(M146L和 L286V)基因。在 3个月时 A 沉积出现,神经炎相关病理变化出现在 5个月时，神经胶质细胞出现在老年斑周围,活性小胶质细胞与斑块并存。在 11周时出现空间保留记忆损害，在 67 周时出现听力惊愕,且进行性加重15 。随着注射 A 肽免疫则 SP和行为学损害有所减轻。开创性的转 APP基因鼠 A
20、D动物模型为研究 A 导致 AD患者出现神经退行性病变发病机制提供了极其有力的工具，使得 AD研究迅速进入一全新的境界，为攻克 AD绘制出最新的起点。2.转 tau基因鼠 一些不含 SP的神经退行性疾病,如 17号染色体相关联帕金森综合征额颞叶痴呆(FTDP17) 、皮质基底退行性疾病、Pick病等存在着由磷酸化 tau构成的 NFT。这些疾病的 NFT不仅分布在神经元内,还分布于胶质细胞中。就目前研究资料而言,在 AD患者中并未发现 tau基因异常,而在 FTDP17 中却发现具有致病性的 tau基因突变。转人类野生型 tau基因小鼠。最早 tau小鼠模型神经元表达长的野生型 tau同型体-
21、htau40，神经纤维前缠结和过度磷酸化 tau蛋白被观察到。在此种小鼠中没有观察到 tau蛋白丝的形成,另一种转基因小鼠htau44也有相似的结果。这些人类野生型 tau基因小鼠显示出与 AD相关疾病中NFT损害的早期改变,但不能产生 NFT并缺乏明显的神经病学症状 。IshiharaT 等16在过表达人类最小 tao蛋白片段转基因小鼠的海马、扁桃体、内嗅皮质形成 congophilic tau,并首次检测出类似 NFT的特定的和 折叠片层结构结合的包涵物。转 tau基因鼠相对转 APP鼠从另一角度诠释 AD中除 A 沉积外另一特征性病变 NFTs，开创研究 AD新的篇章。JNPL3 小鼠。
22、此种小鼠表达人类 FTDP17 突变 tau基因(tau P301L)，通过刚果红、Bielschowsky 和 Bodian银染确认在脑干、间脑、小脑和脊髓有 NFT形成17 。到 10月龄时,90%出现运动和行为学障碍。JNPL3小鼠在出现症状 2周内,衰退扩展到所有肢体,几乎不能移动,出现肌张力障碍性体态。同时体重减轻,梳理、发音和睁眼困难。运动障碍使这些小鼠不能在 Morris迷宫中进行测试。JNPL3 小鼠成为研究 NFT致病机制广泛应用的工具，新近的转基因动物模型多建立在此动物模型基础上。rTG4510 小鼠。这种小鼠的特点是表达了一种可抑制的人类 tau的突变体,导致随年龄增大而
23、增多的 NFT、神经元丢失和严重的前脑萎缩。抑制 RTG4510小鼠转基因 tau的高表达后, 尽管 NFT仍继续蓄积，但小鼠记忆功能恢复,脑内神经元数量稳定,此研究结果提示溶解的 tau比 NFT更具神经毒性18 。转 tau基因鼠证实 FTDP17 突变加速 tau聚合，导致体内神经细胞丢失和功能障碍，展现胶质细胞影响神经元功能的病理变化，最终表现行为学改变。转 tau基因模型作为研究 AD主要病理学特征之一 NFT形成及相关 tau蛋白生化作用的工具，近年发展较为迅速，在 AD研究中发挥着愈来愈重要的作用。3.转 A 与 tau基因鼠 随着转基因动物技术不断完善和发展，在同一转基因鼠内同
24、时表达 AD的两大特征性病理变化 A 和 NFT很快从理论变成现实，把 AD研究再推上新一级台阶，转基因鼠 AD模型从单转基因到双转甚至三转基因迈进，并取得显著成果。Tg2576/tauP301L 小鼠。由 Tg2576小鼠和 tauP301L(JNPL3)小鼠杂交而来。其行为学的发病方式及出现时间和 JNPL3相似，如进行性后肢萎缩,呈弯腰驼背姿势,体重减轻,梳理、发音及睁眼困难。A 沉积同 Tg2576小鼠。NFT 大量出现在边缘系统和嗅觉皮质区19 。APP23/tauP301L 小鼠。由 APP23小鼠和 tauP301L(JNPL3)小鼠杂交而得，其 A 沉积与单转 APP23基因小
25、鼠并无不同，但 NFT病理变化却较将 APP23小鼠脑提取物注入单转 tauP301L基因鼠脑内所致 NFT形成严重，注入的 A 在缺少 A 沉积时触发 tau病理变化，为 AD病人脑内 A 沉积神经解剖学定位与 tau损伤发展及散布的差异提供了注释。3xTgAD 小鼠。Oddo 等分别把两种突变基因APPSwe和 tauP301L显微注射入单转 PS1M146V基因鼠纯合子的胚胎干细胞,得到的小鼠经筛选得到纯合子或杂合子。该三转基因小鼠脑内逐渐出现 SP和 NFT,突触损伤包括随年龄增长而逐渐下降的长时程增强电位出现在 SP和 NFT形成之前。这类小鼠在 6个月时,出现神经元内 A 沉积,而在 12个月时可见细胞外 A 沉积。A 沉积出现在 NFT之前,首先沉积在皮质,然后在海马。12 个月时可出现 NFT,出现的顺序是先海马后皮质20 。这类多种转基因组合方法非常成功模拟了 AD病理变化和行为学改变特征，将会成为研究 AD的主流动物模型得以推广应用。4.其他转基因鼠 结合遗传因素与 AD变化特征，已研制出能复制
