1、酪氨酸激酶抑制剂 A77 1726 阻断 IL13 对成纤维细胞的促胶原合成作用作者：熊丽霞, 李文林, 石小玉, 刘卓琦, 唐洪林【摘要】 目的: 观察酪氨酸激酶抑制剂 A77 1726 对白细胞介素13（IL13 ）促成纤维细胞胶原合成作用的影响。方法: MTT 法观察不同浓度的 A77 1726 对成纤维细胞的增殖作用的影响。成纤维细胞分为实验组和实验对照组, 实验对照组加入 IL13 （100 g/L）, 实验组加入A77 1726（50 mol/L）和 IL13 （100 g/L）, 作用 24、 48、 72 h 后, 羟脯氨酸(Hyp)检测 A77 1726 对 IL13 促进成
2、纤维细胞分泌胶原蛋白的影响, RTPCR 观察 A77 1726 对 IL13 促进成纤维细胞 I 型胶原1 基因 mRNA 水平表达的影响, Western blot 观察 A77 1726 对 IL13促进成纤维细胞分泌 I 型胶原蛋白的影响。结果: A77 1726 可抑制成纤维细胞的增殖。羟脯氨酸检测实验组 48 h 组和 72 h 组成纤维细胞分泌胶原蛋白的含量显著低于实验对照组（P0.05）, RTPCR 观察到实验组 48 h 组和 72 h 组成纤维细胞 I 型胶原 1 基因（COL1A1）mRNA 表达水平显著低于实验对照组（P0.05）, Western blot 观察到实
3、验组48 h 组和 72 h 组成纤维细胞分泌 I 型胶原蛋白的水平显著低于空白对照组（P0.05） 。结论: 酪氨酸酶抑制剂 A77 1726 阻断 IL13 对成纤维细胞的促胶原蛋白合成作用, 阻断 IL13 促成纤维细胞 I 型胶原 1基因 mRNA 水平和蛋白水平的表达。 【关键词】 酪氨酸酶抑制剂 ; A77 1726; 白细胞介素 13; 成纤维细胞; 胶原A77 1726 是免疫调节药来氟米特（Leflunomide, LEF）的中间代谢产物。LEF 是一种具有多重生理活性的新型的异恶唑类免疫抑制剂, 口服吸收后在肝脏和肠壁内被迅速代谢为 A77 1726, 并通过 A77 17
4、26 在体内发挥免疫调节作用, 该代谢物的一个重要作用是抑制酪氨酸激酶活性1, 2 。已证实 IL13 是许多 II 类细胞因子决定的病理过程的关键诱导物, 与多种纤维化疾病的发病机制有关3, 4, 我们前期实验结果显示细胞因子 IL13 可通过 JAK（细胞内一组酪氨酸蛋白激酶）STAT6 （信息传导和转录激活因子）信号转导通路促进成纤维细胞胶原蛋白的合成5, 6, 本实验进一步通过体外培养成纤维细胞, 观察 A77 1726 对成纤维细胞增殖的影响, 以及 A77 1726 和 IL13 共同作用成纤维细胞, 观察 I 型胶原 1 基因表达及对 I 型胶原蛋白合成的变化, 以探讨 A77
5、1726 是否通过抑制 JAK/STAT6 信号转导通路而阻断纤维化的部分机制。1 材料和方法1.1 材料 成纤维细胞株 3T3 细胞, 常规培养在含 150 mL/L 胎牛血清、 1105 U/L 的青、 链霉素的 DMEM 培养液中, 置于 37、 含50 mL/L 的 CO2 孵箱中培养, 实验前, 实验组和对照组细胞均用无血清DMEM 培养 1216 h, 实验组加入 A77 1726（50 mol/L）和IL13 （100 g/L）, 实验对照组加 IL13 （100 g/L） （浓度已做过优化实验, 此浓度最佳） 。IL13 、 Peprotech 公司, A77 1726 为美国
6、欣凯公司上海代表处惠赠, 羊抗 I 型胶原蛋白抗体、 羊抗 actin 抗体、 Santa ruz 公司, HRP 兔抗羊 IgG（II 抗）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Western blot Luminol Reagent(sc2048): Santa Cruz。COL1A1 特异性引物, TaKaRa 公司(大连宝生物), F: 5ACAgAggCATAAAgggTCA3; R: 5CAAggTCACggTCACgAA3 。SV total RNA isolation system（Promega）, RTPCR kit（TaKaRa 公司）, 羟脯氨酸试验检测盒购自南京建成生物工
7、程研究所。1.2 方法1.2.1 MTT 法检测 A77 1726 对成纤维细胞的增殖影响 将细胞以2.5107/L 密度接种于用 96 孔培养板中, 每孔 100 L, 37、 50 mL/L CO2 孵箱中培养至细胞贴壁, 加入 A77 1726, 使之终浓度分别为 0 mol/L、 25 mol/L、 50 mol/L、 75 mol/L、 100 mol/L, 每一浓度重复 5 孔, 37、 5 mL/L CO2 孵箱中培养 20 h , 每孔加入 MTT 20 L, 继续培养 4 h, 吸弃培养基, 用无血清培养液洗 1 次, 加 150 L 二甲基亚枫溶解沉淀, 振荡 10 min
8、, 结晶物溶解。比色: 选择 570 nm 波长, 在酶联免疫检测仪上, 以空白孔调零, 测定各孔光吸收值。以空白未加药物组作为对照组, 其余各组抑制率=(1-实验组 A)/对照组 A100%。1.2.2 羟脯氨酸释放试验观察 A77 1726 对 IL13 促进成纤维细胞分泌胶原的影响 成纤维细胞以 5108/L 接种于培养瓶, 细胞汇合达80%左右时, 无血清 DMEM 培养 1216 h, 实验对照组加 IL13 （100 g/L）单独作用 24、 48、 72 h, 实验组为 IL13 （100 g/L）和A77 1726（ 50 mol/L ）共同作用成纤维细胞 24、 48、 72
9、 h, 细胞培养上清液进行羟脯氨酸释放实验, 比较各实验组和实验对照组羟脯氨酸含量的差别, 按试剂盒说明操作。1.2.3 RTPCR 检测 A77 1726 对 IL13 促成纤维细胞 I 型胶原1 mRNA 表达的影响 取对数生长期细胞, 无血清 DMEM 培养 1216 h, 实验分组同 1.2.2, 用 SV total RNA isolation system 提取总 RNA, 逆转录合成第 1 条 cDNA, 使用 COL1A1 特异性引物, 按照 TKR RTPCR kit 标准程序进行扩增, 产物为 378 bp, 进行 10 g/L 琼脂糖电泳。1.2.4 Western bl
10、ot 检测 A77 1726 对 IL13 促成纤维细胞 I 型胶原蛋白表达的影响 取生长良好的成纤维细胞, 细胞密度51081109/L 接种于培养瓶中, 无血清培养 1216 h 后, 实验分组同 1.2.2, 收集细胞 , 随后各组用 RIPA Buffer 将细胞充分裂解, BioRad Dye Reagent（BioRad ）进行蛋白定量。调整样品中蛋白质含量, 均以 20 g 蛋白量上样进行 70 g/L SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 硝酸纤维膜转印。50 g/L 脱脂奶粉 4封闭, TBS 洗涤, 经 I 型胶原蛋白第一抗体和第二抗体分别孵育后, ECL 试剂显像。再利用清除缓冲
11、液清除硝纤膜上已结合的一抗和二抗, 重新经 actin 一抗、 二抗孵育后, 再次显像, 作为内部参照。对结果利用凝胶定量软件 Quantity One(BioRad) 进行光密度分析。1.2.5 统计学分析 各实验重复 3 次 , 计量资料以 xs 表示, 以 t 检验对实验组和对照组进行差异显著性检验。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 A77 1726 抑制成纤维细胞生长 不同浓度 A77 1726 作用成纤维细胞, MTT 法检测到 A77 1726 可抑制成纤维细胞增殖, 当 A77 1726浓度在 25 mol/L 至 100 mol/L 时, 细胞抑制率明显上升。为此
12、, 取50 mol/L 作为 A77 1726 对成纤维细胞作用的浓度(表 1)。表 1 不同浓度 A77 1726 对成纤维细胞生长的影响（略）Tab 1 The effect of A77 1726 on inhibition rate in fibroblastsaP0.05, bP0.01 vs control.2 2 A77 1726 阻断 IL13 促成纤维细胞分泌胶原 羟脯氨酸是胶原分解代谢的产物, 机体内的羟脯氨酸主要存在胶原中, 因此, 羟脯氨酸是反映胶原含量的重要指标。IL13 和 A77 1726 同时作用成纤维细胞 24 h 后分泌的总胶原含量与单独 IL13 作用 2
13、4 h 组比较可见减弱, 48 h 组可见明显减弱（P0.05）, 72 h 组减弱最显著（P0.01, 图 1） 。图 1 成纤维细胞经 A77 1726 和 IL13 共同作用后羟脯氨酸的变化（略）Fig 1 The effect of A77 1726 and IL13 on Hyp production in fibroblastsaP0.05, bP0.01 vs control.2.3 A77 1726 抑制 IL13 促成纤维细胞 I 型胶原 1 mRNA 表达 RNA 提取后, 用 RTPCR kit(TaKaRa)进行 RTPCR 反应, actin (511 bp)与 CO
14、L1A1 在同一管内扩增, 作为 RTPCR 的内部参照。反应结束, 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳, 结果如图 2A 所示, IL13 对照组以及 A77 1726 和 IL13 共同作用实验各组都出现了明显的 COL1A1mRNA 表达, 即约 378 bp 处的荧光条带, 通过图像扫描, 积分光密度比值分析, 各实验组 COL1A1mRNA 表达与对照组比较, 24 h 组可见减弱, 48 h 组有显著减弱(P0.05), 72 h 组减弱最明显（P0.01, 图 2B） 。IL13 作用24、 48、 72 h 后, 成纤维细胞 COL1A1mRNA 的表达逐渐增强, 而 A77 172
15、6 和 IL13 共同作用 24、 48、 72 h 后, 成纤维细胞 COL1A1mRNA 的表达比 IL13 单独作用组有减弱, 表明 A77 1726 可抑制 IL13 促成纤维细胞 I 型胶原 1 mRNA 的表达。图 2 A77 1726 对 IL13 促成纤维细胞 COL1A1mRNA 表达的影响（略）Fig 2 Effects of IL13 and A77 1726 on the expression of COL1A1 mRNAA: Indicates the result of agar gel electrophoresis of RTPCR; 1: DNA marker
16、; 2, 4, 6: IL13 24, 48, 72 h group; 3, 5, 7: IL13+A77 1726 24, 48, 72 h group. B: Indicates the ratio of luminous density of COL1A1 and actin bands. aP0.05, bP0.01 vs control.2.4 A77 1726 抑制 IL13 促成纤维细胞 I 型胶原蛋白表达 IL13(100 g/L) 和 A77 1726（50 mol/L）作用成纤维细胞不同时间, 裂解细胞提取蛋白质, 进行 Western blot 实验。结果见图 3A 为W
17、estern blot 的结果, 图 3B 为各组 I 型胶原蛋白与 actin 条带的光密度比值。结果显示, 各组在蛋白上样量相等, 内参条带基本一致的情况下, 实验各组均出现了 I 型胶原蛋白条带, 光密度比值分析表明IL13 （100 g/L）和 A77 1726（50 mol/L）作用 24 h 后, I 型胶原蛋白表达可见减弱, 48 h 组表达减弱显著增强（P0.05）, 72 h组表达减弱最明显（P0.01)。IL13 作用 24 h、 48 h、 72 h 后, 成纤维细胞 I 型胶原蛋白的表达逐渐增强, 加入了 A77 1726, 成纤维细胞I 型胶原蛋白的表达显著减弱, 说
18、明 A77 1726 阻断 IL13 促成纤维细胞I 型胶原蛋白的表达。图 3 A77 1726 对 IL13 促成纤维细胞 I 型胶原蛋白表达的影响（略）Fig 3 Effects of IL13 and A77 1726 on the expression of collagen type I proteinA: Indicates the result of Western blot; 1, 3, 5: IL13 24, 48, 72 h group; 2, 4, 6: IL13+A77 1726 24, 48, 72 h group. B: Indicates the ratio of
19、 luminous density of collagen type I and actin bands. aP0.05, bP0.01 vs control.3 讨论我们前期实验结果显示 IL13 能够促进成纤维细胞的增殖, 作用 24 h 后即有 I 型胶原 1mRNA 的表达上调, 且持续至 72 h, 与文献报道一致7 。并证实了 IL13 的该作用是通过将 JAK/STAT6 信号转导中的转录因子 STAT6 磷酸化来实现的。本实验将酪氨酸酶抑制剂 A77 1726 和IL13 一起共同作用成纤维细胞, 结果显示: A77 1726 和 IL13 作用48 h 后 I 型前胶原 mR
20、NA（COL1A1）在成纤维细胞中表达比 IL13 单独作用组明显减弱, 作用 72 h 后几乎达到完全阻断, 这与实验中 I 型胶原蛋白合成量的变化相符。I 型前胶原 mRNA 是成纤维细胞合成 I 型前胶原蛋白所必须的翻译模板, 其含量减少, I 型前胶原的翻译速度必然下降, 同样条件下 I 型前胶原合成量减少, 则成纤维细胞分泌 I 型胶原蛋白下降。因此我们认为 A77 1726 能通过抑制成纤维细胞内 I 型前胶原 mRNA 的转录, 而抑制成纤维细胞合成分泌 I 型胶原蛋白。推测这种阻断作用的可能原因是: （1）A77 1726 抑制成纤维细胞的生长增殖造成分泌细胞总数量减少, 与
21、MTT 实验结果相符。我们的实验结果显示 A77 1726 25 mol/L 浓度不抑制成纤维细胞生长, 而 50 mol/L 浓度可显著抑制成纤维细胞生长, 故选择 50 mol/L 作为 A77 1726 的使用浓度。 （2）A77 1726 通过抑制 IL13 信号转导通路中的 STAT6 的磷酸化, 使之不能形成二聚体进入核内与胶原基因启动子结合, 而抑制胶原基因的转录和翻译。相类似的文献报道有: Si 等8的研究表明, 用 A77 1726 预处理肝星状细胞（HSC）可通过阻断 3 种信号转导通路 JAK/STAT 通路、 MAPK 通路、 PI3K/AKB 通路而显著抑制 HSC
22、的增殖从而抑制 HSC 中的 I 型胶原蛋白的沉积, 阻断肝纤维化进程。另外 Yao 等9, 10的研究显示 A77 1726 可抑制 HSC 的增殖和胶原合成, 而抑制由 CCl4 诱导的大鼠肝纤维化, 其机制可能与其抑制致 HSC 激活的因子如 TGF 、 TNF 和 IL1 分泌有关。Akiho 等11研究表明 A77 1726 可抑制 IL4 和 IL13 诱导下的 STAT6 的 DNA结合活性, 且效果与抗 STAT6 抗体相同。近期研究表明, IL4 和IL13 可以显著增强角质细胞 HaCaT 表面 CCL26 的产生, 但 A77 1726 通过抑制 JAK1STAT6 依赖
23、的通路, 对其增强作用产生阻碍12 。综上所述, 本研究表明, A77 1726 阻断 IL13 促成纤维细胞 I 型胶原 1 基因 mRNA 水平和蛋白水平的表达, 因此其对纤维化的抑制作用值得进一步研究。【参考文献】1 丁新国, 李晓东, 张红梅, 等. 来氟米特对紫癜性肾炎患者血清 IL6 、 IL8 及 TNF 水平的影响J. 细胞与分子免疫学杂志, 2007, 23(12): 1176-1177.2 Siemasko K, Chong AS, Jack HM, et al. Inhibition of JAK3 and STAT6 tyrosine phosphorylation b
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