1、卵黄抗体用于血吸虫循环抗原检测的可行性研究作者：吴玉龙 张炜明 刘文琪 仇镇宁 冯振卿 李雍龙 管晓虹 【摘要】 目的 探讨抗可溶性虫卵抗原（SEA）鸡卵黄抗体（Immunoglobulin Y, IgY）用于血吸虫循环抗原检测的可行性。方法 以纯化的鸡抗 SEA 卵黄抗体为捕捉抗体，以酶标抗 SEA 单克隆抗体NP285B 进行双抗体夹心酶联免疫吸附试验法（SELISA ）检测急、慢性血吸虫病病人和健康人血清，并与常规检测抗体的酶联免疫吸附试验（SEAELISA ）法做比较。结果 SELISA 法测得 SEA 浓度（y）与 A450值（x）呈明显的正相关（r=0.9481,y=459.22x
2、-108.14） ；SELISA 法检测急性血吸虫病人循环抗原的阳性率为 100%，慢性血吸虫病人循环抗原的阳性率为 84.4%，健康人的特异性为 96.0%；两种方法对血吸虫病的检出率差异无统计学意义（P0.05） 。结论 SELISA 可用于血吸虫病的免疫诊断。 【关键词】 血吸虫；免疫诊断；循环抗原；卵黄抗体 【Abstract】 Objective To analyze the feasibility on detection of circulating schistosome antigen with antiSEA chicken immunoglobulin Y(IgY).Me
3、thods Using chicken antiSEA IgY as the captureantibody and an antiSEA mouse mAb conjugated with HRP as the detection antibody, a sandwich ELISA technique was established to detect the circulating schistosome antigen in serum samples of patients with acute, chronic schistosomiasis and healthy people.
4、 The results were compared with those of SEAELISA. Results There was an obviously positive correlation between SEA concentration and A450 value. The regression equation was deduced （r=0.9481,y=459.22x-108.14）. The positive rates of SELISA for testing acute, chronic schistosomiasis patients were 100%
5、 and 84.4%, respectively.The specificity of healthy people was 96.0%. No significant difference was observed between the two ELISA methods.Conclusion SELISA could be used in immunodiagnosis of schistosomiasis. 【Key words】 schistosome,immunodiagnosis,circulating antigen,egg yolk antibody 血吸虫病是一种严重危害人
6、类健康的人兽共患寄生虫病。研究高度特异和敏感的既有诊断价值又有疗效考核价值的循环抗原检测方法仍是当前血吸虫病应用基础研究的重要内容1 。特定的抗原免疫产蛋母鸡后，可产生相应的抗体转移和积累于蛋黄中，从蛋黄中提取的抗体鸡卵黄抗体（IgY） 。IgY 因其生物学特性和制备上的优势，正在成为生物技术和医药研究领域的热点2,3 。本研究应用抗血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）多克隆卵黄抗体和酶标单克隆抗体组合建立一种双抗体夹心法来检测血吸虫循环抗原，以分析卵黄抗体用于血吸虫病诊断的可行性。 1 材料与方法 1.1 抗体制备及酶标记 取 60 g SEA 与等体积的福氏完全佐剂混合经翅膀下静脉免疫海兰蛋鸡，
7、首次免疫 7 d 后开始收集鸡蛋。取卵黄与蒸馏水按 19 比例充分搅拌混匀，置 4过夜，静置分层取上清4 10 000 r/min 离心 25 min，取上清加入 19%硫酸钠，45水浴中充分搅拌溶解，再离心，用适量蒸馏水溶解沉淀置透析袋中 4透析过夜，收集分装后置-20保存备用；复苏本实验室保留的 NP285B 阳性杂交瘤细胞株，传代培养后收集培养细胞上清，用 50%饱和硫酸铵沉淀后，溶解于 0.01M，pH7.4 的 PBS,充分透析后放置-70冰箱备用。经免疫双扩散鉴定，NP285B 的同型为 IgG1，其靶抗原分子量为 140 kD。 采用简易过碘酸钠法，将辣根过氧化物酶（HRP, R
8、Z3.0, 批号 20080219）结合至 NP285B 上，经滴定确定其工作浓度为 160011 000。 1.2 检测血清来源 急性血吸虫感染病人血清 9 份和慢性感染病人血清 45 份分别采自江西九江都昌县血防所和云南省大理白族自治州巍山县鼠街乡鼠街村。正常人血清 50 份取自山东省滨州市门诊病人。 1.3 SELISA 检测方法的建立 将 IgY 溶于 pH9.6、0.1 mol/L 碳酸盐缓冲液中，以此液 100 l 包被 ELISA 反应孔中，4过夜；次日甩干孔中液体，PBST 液洗涤 3 次，用 10% 的脱脂牛奶 37封闭 2 h，PBST液洗涤 3 次；加入 1100 稀释的
9、待测血清 100 l，37 孵育后，PBST 液洗涤 3 次；加入稀释好的 HRPNP285B 100 l 37 孵育，PBST 液洗涤 610 次，采用 TMB/H2O2 显色方法，37 下避光显色 10 min 后，每孔加入 50 l 2 mol/L H2SO4 终止显色反应，450 nm 波长处测定吸光值(A450)。每板均设阳性对照和阴性对照，以 A 值阴性对照的 2.1 倍作为阳性判定标准。通过正交试验来确定最佳检测条件，选用L12（211）正交表，设立 4 个实验因素，每因素设 2 个水平，分别为：IgY 包被浓度（5 g/ml，10 g/ml ） 、血清孵育时间（60 min,3
10、0 min） 、酶标抗体浓度（1600,11 000）和酶标抗体孵育时间（45 min,30 min） 。 1.4 统计学分析 采用 2 检验对 SELISA 法和 SEAELISA 法检测的敏感性与特异性进行两两比较。 2 结果 2.1 正交试验结果 使用上述正交表对 4 个实验因素的各个水平进行条件组合（表 1） ，每一组合条件下，都检测同一份阳性参考血清和阴性参考血清，每个组合实验重复 3 次。阳性参考血清与阴性参考血清A450 差值越大，则表明该组合所对应的检测水平是最佳。最终确定的检测条件为：包被浓度 12 000、血清孵育时间为 60 min、酶标抗体浓度为 11 000、酶标抗体
11、孵育时间为 30 min。 2.2 SELISA 法检测血吸虫病病人血清循环抗原的敏感性与特异性 用 SELISA 法和 SEAELISA 法分别检测急性血吸虫感染病人血清 9 份，慢性血吸虫病人血清 45 份，所得阳性率分别为 100%、84.4%和100%、95.6%；非感染区正常人血清 50 份，特异性分别为 96%、94%。如表 2 所示，2 检验分析两种方法检测血吸虫病人血清的敏感性与特异性差异均无统计学意义（P0.05） 。表 1 正交设计确定的检测条件实验号IgY 包被浓度表 2 SELISA 和 SEAELISA 法检测血吸虫病人和正常人结果 2.3 循环抗原的量化检测 将 S
12、EA 标准抗原（ 90 g/ml）溶于1100 稀释的正常人血清中配成不同浓度系列（22.5900 ng/ml）作为待测标本，每一浓度重复 3 孔；将 SELISA 检测 SEA 所得的 A450 均值与对应的浓度绘图，图 1 所示各点呈现直线趋势，计算得到直线回归方程为：y=459.22x-108.14，r=0.9481，表明抗原浓度与吸光度值之间呈明显的正相关。 3 讨论 血吸虫循环抗原的检测可区分现症感染和既往感染，可作为疗效考核指标。建立高敏感性的循环抗原检测方法是当前血吸虫病防治中亟待解决的问题之一。现有的血吸虫循环抗原检测方法敏感性还有待提高，尤其是在慢性感染者。其原因可能是因为循
13、环抗原多为血吸虫的代谢分泌物，易受到机体免疫系统的清除，从而导致循环抗原在血清中含量不高，特别是在一些低感染或慢性感染者4，5 。此外，独特性抗体的存在也能影响到循环抗原的检测。近年来，研究者们都在致力于提高血吸虫循环抗原检测的敏感性与特异性68 。本研究利用抗 SEA 的鸡卵黄抗体作为捕获抗体、酶标抗 SEA 单克隆抗体 NP285B 的夹心 ELISA 法对9 例急性血吸虫感染病人血清和 45 例慢性感染病人血清进行检测，结果显示急慢性血吸虫感染病人循环抗原检测的阳性率为 100%和 84.4%。50份非疫区正常人检测的特异性达 96.0%。统计分析结果表明本研究所建立的双抗体夹心法对急、
14、慢性血吸虫病的检出率与经典的抗体法（SEAELISA ）检测结果相似。有人应用从重感染兔血清中提取的 球蛋白为捕捉抗体、酶标 NP285B 为检测抗体的双夹心 ELISA 检测慢性日本血吸虫病患者循环抗原的阳性率为 88.2%6 ，本研究结果与此基本一致。表明本法检测循环抗原具有较好的敏感性与特异性。 卵黄抗体 IgY 是产蛋母鸡受到特异性抗原的免疫刺激后，由血清中产生相应的特异性抗体转移至卵黄中蓄积而成的多克隆抗体。从卵黄中提取的 IgY 纯度高、含量大、制备及纯化技术简单成熟。由于鸡与哺乳动物种系发生学关系较远，IgY 还具有一些不同于哺乳动物 IgG 的特点9,10：不与血清中的类风湿因
15、子（RF）结合，不激活哺乳动物补体系统，也不与 Fc 受体结合，将 IgY 应用于免疫诊断中，可减少假阳性的出现，从而提高检测的特异性。 本研究所建立血吸虫循环抗原检测方法采用多抗与单抗夹心的检测模式，从理论上分析，多抗针对抗原的位点多，用作捕捉抗体可以提高检测的敏感性；而单抗针对抗原的位点单一，用作检测抗体则可以提高检测的特异性。此外，用正交实验对所建立的双夹心 ELISA 法分别从 4个实验因素 2 水平进行分析从而确定最佳的检测条件。从各组检测条件组合中选取阳性参考血清与阴性参考血清 A450 差值最大的组合作为最终检测的条件。如用普通的排列组合，则需要进行 16 次实验，而应用正交设计
16、实验则可减少实验次数，提高实验效率。 作为一种制备简便而又经济的抗体技术，卵黄抗体技术有望成为制备动物多克隆抗体的一种常规的优良的替代技术，其在医学上的应用正深受越来越多研究者的重视，有进一步研究和推广的价值。 为增加试验结果的可信性，进一步验证本研究所建立的检测方法在血吸虫病诊断中应用的可行性及应用价值，下一步我们将扩大检测范围，进行进一步的实验，收集更多的数据，以利于方法的改进。 【参考文献】 朱荫昌，管晓虹，杨小红，等.抗 rSjCTPI 单克隆抗体检测血吸虫循环抗原的研究J.中国寄生虫病杂治杂志,2000,13(4): 285287. 2 Hoon HS, Welson WW,Jeon
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