1、慢性阻塞性肺疾病 TNFA 和 LTA 基因等位基因变异分析【摘要】 研究中国北方汉族人群中 TNF 超家族基因等位基因变异是否与慢性阻塞性肺疾病（COPD）相关联。方法 以 50 例 COPD 患者为研究对象，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法研究TNF 超家族基因（TNFA 和 LTA）等位基因变异分布。结果 COPD 组 TNFA基因多态性位点-308G/A AA 基因型频率明显高于对照组（P0.01）,OR 值为 10.756（95% CI 为 9.87512.640）; COPD 组-308G/A 多态性位点 A 等位基因频率明显高于对照组（P0.01）
2、；COPD 组 LTA 基因+252A/G 多态性位点 AG 基因型频率明显高于对照组（P0.01） ，OR 值为 4.373（95% CI 为 3.3016.872） 。COPD 组 TNFA 基因 GG 正常基因型和 LTA 基因 AG 杂合基因型结合个体频率明显高于对照组（P0.05） 。2组间 LTA 基因+252 A/G 多态性位点 G 等位基因频率差异无统计学意义(P0.05)。结论 中国北方汉族人群 LTA 基因等位基因变异、TNFA 基因多态性变异组合与 COPD 相关联。 【关键词】 慢性阻塞性肺疾病 TNFA 基因 LTA 基因 遗传多态性 Abstract: Object
3、ive To investigate whether TNF-gene allele variation is associated with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) of Han population in northern China. Methods 50 cases of COPD were selected as subjects for TNF-superfamily-gene (TNFA and LTA) allele variation distribution by the method of polymera
4、se chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Results Compared with the control group, COPD group had a higher frequency of AA-genotype at TNF-gene polymorphism space point-308G/A (P0.01), OR value was 10.756 (95% CI as 9.875-12.640); COPD group had a higher frequency of A a
5、llele genotype at -308G/A polymorphism space point （P0.01）; COPD group had a higher frequency of AG allele genotype at LTA-gene +252A/G polymorphism space point (P0.01), OR value was 4.737 (95% CI as 3.301-6.872); COPD group had higher frequency of TNFA-gene GG normal genotype and LTA-gene AG hybrid
6、 genotype (P0.05). No significant difference in frequency of G allele genotype at LTA-gene polymorphism space point +252A/G was found between COPD group and the control group (P0.05). Conclusion The LTA-gene allele variation and the TNFA-gene polymorphism variation are associated with COPD in Han po
7、pulation in northern China. Key words: chronic obstructive pulmonary disease; TNFA gene; LTA gene; genetic polymorphism 慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）是内科系统常见病、多发病，慢性炎症是 COPD 发病过程中的重要特征。参与肺部炎症调节的细胞因子在 COPD 发病过程中起重要作用。肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-, TNF-)是一个多功能的细胞因子，它促进气道重构，改变平滑
8、肌细胞功能，参与肺部炎症调节，从而在 COPD 发病过程中起重要作用。淋巴毒素-(lymphotoxin, LT-)也是炎症细胞介素，主要由淋巴细胞合成。2 种细胞因子都与细胞表面的相同受体有关系。编码这 2 种细胞因子的 TNFA 和 LTA 基因彼此连锁并位于6 号染色体短臂（6p21.1-6p21.3）主要组织相容性复合体簇范围内。关于 TNFA 和 LTA 基因不同等位基因变异影响 TNF- 和 LT- 表达水平问题始终意见不一。已证明与 G 等位基因比较，A 等位基因与细胞因子产物成倍的增高有关1-2 。在亚洲某些群体发现 TNFA 基因的 A 等位基因与某些呼吸系统疾病表型关联,而
9、在欧洲群体迄今未得到证实。LTA 基因第一内含子+252A/G 多态性对肺部疾病的作用研究很少。本研究的目的是探讨 TNFA 和 LTA 基因等位基因变异与 COPD 的相关性。 1 资料和方法 1.1 研究对象和分组 所有 COPD 患者均为中国北方汉族人，COPD组选取 2004 年 12 月2006 年 2 月在我院呼吸科住院的 COPD 患者 50 例，诊断符合 COPD 诊治指南3 ，年龄 5883 岁，平均（62.4113.38）岁。对照组选取我院同期健康体检者 50 例，年龄 5679 岁，平均年龄（58.9212.53）岁，X 线胸片和肺功能正常。同时均排除支气管哮喘、肺癌、肺
10、间质纤维化等呼吸系疾病及冠心病、高血压等具有遗传倾向的疾病。 1.2 方法 1.2.1 基因组 DNA 的提取 用标准苯酚-氯仿法从外周血抽提基因组 DNA。 1.2.2 PCR TNFA 基因-308G/A 和 LTA 基因+252A/G 的检测用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法。各位点引物序列、PCR 片段大小及酶切反应条件见表 1。PCR 反应体系为 25 l，包括 4 l 模板基因组 DNA,10PCR 缓冲液 2.5 l，Mg2+浓度 2.0 mmol/L,1 mmol/L dNTPs 2.5 l,引物各 5 pmol, Taq DNA 聚合酶 4 U（北京
11、鼎国生物技术有限责任公司） ，不足体积用灭菌双蒸馏水补充至 25 l。TNFA基因-308G/A PCR 反应循环参数：94预变性 5 min；94变性 60 s，61（LTA 基因+252A/G 为 64）退火 45 s，72延伸 60 s，32 个循环；最后 72延伸 7 min。扩增后取反应产物 4 l 在 2%琼脂糖凝胶上电泳 15 min（电压 120 V） ，紫外线灯下鉴定 PCR 产物。表 1 引物序列与 PCR、酶切反应条件 1.2.3 酶切条件及体系 采用限制性片段长度多态性(RFLP)检测TNFA 和 LTA 基因的多态性（表 1） 。在 20 l 体系中，加入 10 l
12、PCR产物，10缓冲液 2 l，Nco（北京鼎国生物技术有限责任公司）4 U(0.5 l),不足体积用灭菌双蒸馏水补充，37孵育 56 h。 1.2.4 TNFA 和 LTA 基因多态性的分析 对于 TNFA 和 LTA 基因，分别取酶切产物 5 l 在含 0.5 g 溴化乙啶（ EB） （1 g/L）的 3%琼脂糖凝胶上电泳 1520 min，根据紫外灯下观察到的酶切产物片段长度鉴定等位基因并照相。 1.3 统计学处理 采用 SPSS 11.5 进行统计学分析。各组间各基因型和等位基因频率的比较以及 Hardy-Weinberg 遗传平衡定律的吻合度检验采用 2 检验；相对危险度采用比值比（
13、odd ratio, OR）和 95%可信区间（confidence interval, CI） 。统计学显著性检验均为双侧，以P0.05 为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 TNFA 和 LTA 基因的突变位点及突变规律 TNFA 基因-308G/A 多态性位点 PCR 产物经 Nco酶切后电泳结果见图 1。TNFA 基因 PCR 产物长度为 107 bp,G 等位基因特点是存在 Nco酶切点，可被切成 87 bp 和 20 bp 2 个片段。A 等位基因无 Nco酶切点，为 107 bp 1 个片段。所以，在电泳后 GG 基因型为 87 bp 和 20 bp 2 个片段;AA 基因型
14、为 107 bp 1 个片段；AG 基因型为 107 bp、87 bp 和 20 bp 3 个片段。LTA 基因+252A/G多态性位点 PCR 产物经 Nco酶切后电泳结果见图 2。LTA 基因 PCR 产物长度为 368 bp，其中 A 等位基因特点是缺少 Nco 酶切点为 368 bp 1 个片段，G 等位基因存在 Nco酶切点被切成 235 bp 和 133 bp 2 个片段。所以，在电泳后 AA 基因型为 368 bp 1 个片段 ;GG 基因型为 235 bp 和133 bp 2 个片段;AG 基因型为 368 bp、235 bp 和 133 bp 3 个片段。 2.2 Hardy
15、-Weinberg 平衡检验结果 在 TNFA 和 LTA 基因中，COPD组、对照组各种基因型频率的分布符合 Hardy-Weinberg 平衡规律（表 2） 。2.3 2 组 TNFA 基因-308G/A 多态性位点基因型和等位基因频率分布的比较 见表 2。与对照组比较，COPD 组 TNFA 基因-308G/A 多态性位点AA 基因型频率明显高于对照组（P=0.008） ，COPD 组-308G/A 多态性位点A 等位基因频率也明显高于对照组(P=0.004)。表 2 TNFA 基因-308G/A多态性位点基因型和等位基因频率分布 2.4 2 组 LTA 基因+252A/G 多态性位点基
16、因型和等位基因频率分布的比较 见表 3。与对照组比较，COPD 组 LTA 基因+252A/G 多态性位点AG 基因型频率明显高于对照组（P=0.001） ，2 组间 LTA 基因+252A/G 多态性位点 G 等位基因频率差异无统计学意义（P0.05） 。表 3 LTA 基因+252A/G 多态性位点基因型和等位基因频率分布 2.5 TNFA 和 LTA 基因多态性位点基因型组合（TNFA-LTA）关联分析 因为 TNFA 和 LTA 基因产物功能上同属于一个炎症介质系统，所以分析其基因型的组合与 COPD 发生风险关联是合理的。根据 Warzocha 等4提出的高风险和低风险基因型,将所有
17、可能的基因型组合分为 2 组，仅存在1 个与细胞介素高产物关联的等位基因（TNFA 基因 A 等位基因或 LTA 基因 G 等位基因）的基因型组合属于低风险组：即 GG-AA、GG-AG、GA-AA组合。与 TNF- 或 LT- 增高分泌作用有关的 2 个以上等位基因的基因型组合列入高风险组：即 GG-GG、GA-AG、GA-GG、AA-AA、AA-AG、AA-GG结合。基因型组合频率分布见表 4。COPD 组和对照组之间高风险和低风险基因型组合频率差异无统计学意义（P=0.73） 。表 4 TNFA 和 LTA 基因多态性位点基因型组合（TNFA-LTA）关联分析 3 讨 论 本研究结果提示
18、，TNFA 基因 AA 基因型与我国 COPD 患者的易感性明显相关。与相关资料比较，本研究 COPD 患者 TNFA 基因 A 等位基因频率与日本和韩国 COPD 患者 TNFA 基因 A 等位基因频率相似5 。但欧洲COPD 患者中 TNFA 基因 A 等位基因与发病无关联。意大利 COPD 患者TNFA-308A 等位基因频率为 11%，欧洲出生健康个体组和非阻塞性支气管炎患者组该等位基因频率为 10%，这与相应对照组 A 等位基因频率高有关系（8%27%） 。 本研究结果还显示 COPD 组 LTA 基因+252A/G 多态性位点 AG 基因型频率比对照组显著增高，但 G 等位基因频率
19、与 A 等位基因频率与对照组差别不大。COPD 组和对照组的 LTA 基因 G 突变等位基因频率为 30%，这可能与研究的病例例数较少有关。 Patuzzo 等6研究了意大利COPD(n=66)患者 LTA 基因+252A/G 多态性，未发现 TNFA 和 LTA 基因多态性变异与发病之间的关系。Yamaguchi 等7研究日本的结节病患者的遗传多态性时发现，G 等位基因是慢性病程标记基因。 一些研究表明，LTA 基因突变可以影响 LT- 表达水平，可能对COPD 发病机制具有意义。但是这个细胞介素生物学功能目前很少研究。已知 LTA 基因突变等位基因 G 与人类外周血单核细胞介素更多产物关联
20、。此外，发现 G 等位基因处于与 LTA 基因编码区域的突变连锁，它引起蛋白质产物 26 位天门冬酰胺替代苏氨酸（Thr26Asn）,可以影响 LT- 的生物活性水平。但是为了证实这个假说尚需要进一步的研究。 Barnes 等8研究人外周血淋巴细胞时发现 NF-B 因子诱导和LT- 诱导之间相关，而 NF-B 转录因子是炎症应答的许多基因表达调控的主要因子之一,在氧化剂、细菌、病毒和不同抗原等作用下活化合成炎症细胞介素 TNF-、IL-1、IL-2、IL-6、巨噬细胞和粒细胞-克隆刺激因子，以及参加 COPD 病理过程的 IL-8。分析 TNFA 和 LTA 基因多态性位点基因型组合，在 CO
21、PD 患者中常出现 TNFA 基因的 GG 基因型和 LTA 基因 AG 杂合基因型组合的个体，这个基因型组合的个体 COPD 发生风险明显增高。 意大利研究者进行了健康对照组和 COPD 患者组之间基因型组合类似分析6 。COPD 患者最常出现的 GG-AA 组合频率为 45%，对照组为45.9%；COPD 患者组 GG-AG 组合频率（29.2%）没有超过健康对照组（31.5%） ，但在 COPD 组观察到 GG-GG 和 GA-AA 组合频率增高倾向。 我们的研究描述了 TNFA、LTA 基因的基因型，以及 TNFA 和 LTA 基因的基因型组合，它们与 COPD 的易感性相关。在临床上
22、可作为遗传性标记进行检测，用于早期发现 COPD 的易感人群，对于预防 COPD 的发生发展具有一定的实际意义。但几种基因型的多态性显然不能解释 COPD 发病中全部的基因调控机制及其遗传易感性8 。今后的工作将集中在多基因的多态性与 COPD 易感性的关系，以寻找出预防 COPD 发生发展的多种基因标志。 【参考文献】 1 Wilson AG， Symons JA， McDowell TL， et al. Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcriptional
23、 activation J. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(7):3195-3199. 2 Palmer SM, Klimecki W, Yu L, et al. Genetic regulation of rejection and survival following human lung transplantation by the innate immune receptor CD14J. Am J Transplant,2007,7(3):693-699. 3 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性肺疾病诊治指南J.中华结核和呼吸杂志,200
24、2,25(8):453-460. 4 Warzocha K, Ribeiro P, Bienyenu J, et al. Genetic polymorphisms in the tumor necrosis factor locus influence non-Hodgkins lymphoma outcome J. Blood,1998,91(10):3574-3581. 5 Huang SL, Su CH, Chang SC. Tumor necrosis factor- gene polymorphism in chronic bronchitis J. Am J Respir Cri
25、t Care Med,1997,156(5):1436-1439. 6 Patuzzo C, Gil LS, Zorzetto M, et al. Tumor necrosis factor gene complex in COPD and disseminated bronchiectasis J. Chest,2000,117(5):1353-1358. 7 Yamaguchi E, Itoh A, Hizawa N, et al. The gene polymorphism of tumor necrosis factor-, but not that of tumor necrosis factor-, is associated with the prognosis of sarcoidosis J. Chest,2001,119(3):753-761. 8 Barnes PJ. Nuclear factor-kappa B J. Int J Biochem Cell Biol,1997,29(6):867-870.
