1、蒙药冷蒿的遗传多样性随机引物多态性分析作者：刘越 潘宁，黄怡鹤，温婧，周廉【摘要】 目的研究内蒙古通辽地区蒙药冷蒿的遗传特异性及通辽、呼和浩特、锡林郭勒 3 个不同地区蒙药冷蒿的遗传多样性。方法采用随机引物多态性(RAPD)方法，从 17 组 RAPD 引物中筛选出 13 组条带清晰、多态性明显并且重复性好的引物用于实验，并利用 Popgen32 和 NTSYS 软件进行数据计算与聚类分析。结果13 组引物共产生的 209 条带中，有201 条多态性带，多态位点百分率达 96.17%。 3 个地区蒙药冷蒿Ht=0.238 1， Hs=0.187 4， Dst=0.050 7，地区间的 Gst=
2、0.212 9。通过 UPGMA 分析，呼和浩特与锡林郭勒盟冷蒿聚为一类，通辽冷蒿单独聚为一类。结论冷蒿具有较高的遗传多样性且不同地区差异明显。冷蒿居群总的遗传多样性来自于居群内(78.71%)，且居群间有基因的交流。 【关键词】 冷蒿种群; 改进 CTAB; RAPD; 遗传多样性Abstract：ObjectiveTo study the genetic diversity of Atremisia frigida in Tongliao population and three different regions of Inner Mongolia (Tongliao, Hohhot,
3、Xilingol). Methods13 groups of primers with clear, obviously polymorphic and reproducible bands were screened from the 17 groups of primers by random amplified polymorphic DNA (RAPD) method. The bands produced by the 13 groups of primers were calculated and analyzed through Popgen32 and NTSYS softwa
4、re. Results 13 groups of primers generated 209 bands, including 201 polymorphic bands. The percentage of polymorphic loci was up to 96.17%. The Neis genetic diversity and Shannons information were different in the three different regions. Total genetic diversity (Ht) of three Atremisia frigida popul
5、ation was 0.238 1. Genetic diversity within three populations (Hs) was 0.187 4. Genetic diversity among populations (Dst) was 0.050 7. Genetic differentiation coefficient among populations (Gst) was 0.212 9. In accordance with UPGMA based on genetic distance analysis, A. frigida of Hohhot and Xiling
6、ol clustered into one category, A. frigida of Tongliao clustered into a separate category.Conclusion A. frigida has a high genetic diversity, and the genetic diversities of A. frigida in three regions are different. The total genetic diversity is from the genetic variation within A. frigida populati
7、ons (78.71%). Meanwhile, there are genetic exchanges among populations.Key words：Artemisia frigid population; Improved CTAB; RAPD; Genetic diversity蒙药冷蒿 Atremisia frigida(蒙语：阿给)，又名小白蒿、菟毛蒿，菊科蒿属的小灌木，是蒙医的常用药，主要分布在内蒙古13。近年来，随着中药材标准化进一步深入，为提高中药质量和临床效果，中药材的道地性的研究越来越受到重视46。但对民族药的道地性研究甚少。长期以来，蒙药冷蒿一直在民间用于出血疾
8、病的治疗7。研究发现，不同产地来源的蒙药冷蒿制炭后止血效果差异显著，而且来自荒漠草原的蒙药冷蒿制炭后活性成分的含量偏高。目前，冷蒿药材来源为野生冷蒿，随着荒漠化的进程，以及药材的大量开采，将使冷蒿变成濒危物种。为了避免野生药用植物的枯竭，势必要进行药材的规范化栽培种植(GAP)，对冷蒿遗传背景的分析，不但可以从遗传学角度观察引起冷蒿质量变异的原因，也可以为冷蒿栽培种植提供理论指导。在 PCR 基础上建立起来的随机扩增多态性(random amplified polymorphic DNA，RAPD)分子标记技术，以其技术简单易行，分析速度快，成本低，不用进行 DNA 克隆、southern 杂
9、交等复杂程序的优点，特别适合于遗传背景不清楚的材料的研究，在中药材鉴定与遗传多样性研究中应用广泛810。本实验采用 RAPD 方法，考察冷蒿的遗传结构，探讨冷蒿止血活性成分变异的遗传学基础。1 材料2007-11 分别在呼和浩特、锡林郭勒盟当地收集冷蒿干药材;2008-09 在内蒙古通辽市奈曼旗采集冷蒿植株，并用冰块冷冻保存。3 个冷蒿群体编号见表 1，群体间空间距离大于 500 km。2 方法2.1 基因组 DNA 的提取与测定基因组 DNA 采用改进的 CTAB 法11提取。DNA 大小及其完整性采用标准浓度的 DNA/Hind检测，采用 SAM 3000 微量紫外/可见分光光度计测定 A
10、260、A280 及 A230，据此推知各样本总 DNA 的含量。2.2 RAPD 引物的筛选参照王静12以及本实验室11的方法，优化 PCR 反应体系，对单一 DNA 样品多引物进行 RAPD-PCR 扩增。在 Bio-RAD Gel Doc 2000 凝胶成像系统上观察拍照。最后，筛选出可产生多态性且重复性好的引物组合。表 1 材料来源Tongliao)E122.16 500350450 沙地 31 株 H 呼和浩特 N40.82(Hohhot)E111.81580335534.6 荒漠草原药材 L 锡林郭勒 N43.95(Xilingol)E115.46790295 典型草原药材2.3
11、数据处理与统计分析构建二元数据矩阵，RAPD 为显性标记，同一引物的扩增产物在电泳中迁移率相同的条带被认为是同源性的，属于同一位点的条带按清晰可见的强带或反复出现的弱带记为 1，无带记为0，形成二元数据矩阵。根据“0-1”原始矩阵，用 Popgen32 软件计算多态位点比率(P)、Nei s 遗传多样性指数(h*)、Shannon 信息指数(I*)、总群体的基因多样性(Ht)、群体内基因多样性(Hs)、群体间基因多样性(Dst)、基因分化系数(Gst)、遗传距离(D)和遗传一致度(I)。利用 NTSYS 软件进行各品种间 UPGMA(unweighted pair group method w
12、ith arithmetic mean)聚类分析，构建聚类树图。3 结果用来自不同种群的个体，从王静已经筛选的 17 个引物12中，选定适用于干药材扩增的 13 条(组)引物(见表 2)。表 2 RAPD 扩增引物、序列及总扩增结果3.1 通辽居群内部遗传多样性分析本课题组采用通辽 31 株冷蒿样本的 DNA 作为通辽地区冷蒿居群内 RAPD 扩增的样本。DNA 样品的 RAPD-PCR 扩增。结果见图 1。3.1.1 居群内 RAPD 扩增带的多态性分析 13 个引物在通辽 31 株冷蒿样本中共扩增条带数为 209，多态性条带数为 180，多态位点比率为86.12%，平均每个引物扩增的 DN
13、A 带数为 13.8 条，位点分子量范围均在2002 000 bp 之间。3.1.2 居群内样本的聚类分析遗传相似度在 0.220.76 之间，其能够在一定程度上反应个体间 DNA 的差异，根据相似度计算遗传距离(本研究中各个体间遗传距离未列出)，从而利用 UPMGA 法进行聚类分析，得到个体间亲缘关系分枝树系图。结果见图 2。图 2 通辽地区居群内的聚类分析图3.2 居群间遗传多样性分析呼和浩特、锡林郭勒冷蒿干药材混合均匀，随机取样进行 DNA 的提取，选取 DNA 完整性好、含盐量少，RAPD扩增结果稳定的 3 个不同批次的 DNA 样本，代表其所在居群进行遗传多样性检测和分析。鉴于居群遗
14、传多样性指数与居群样本数相关，随机从通辽 31 个 DNA 样本中选取 5 个样本，进行居群间遗传多样性分析。通过对通辽居群 5 个样本的 Nei s 指数、Shannon 指数两个准确反映遗传多样性的数据进行 t 检验，所得到的 t 值均小于 2.78(df=4,=0.05 双尾检测)，说明随机选取的样本和总样本无差异，能代表通辽地区的遗传多样性。3.2.1 居群间 RAPD 产物的多态位点分析通辽 5 个样本、呼和浩特3 个混合样本、锡林郭勒 3 个混合样本共 11 个样本通过 13 对引物扩增产生 209 条带，其中 201 条带有多态性，平均每对引物产生 15.5 条;整体多态位点百分
15、率达 96.17%，通辽、呼和浩特、锡林郭勒 3 个居群具有不同的遗传多样性。其中，通辽居群内多态性带为 159 条，多态位点百分比为 76.08%，呼和浩特多态性条带为 78 条，多态位点百分比为37.32%，锡林郭勒多态性条带为 110 条，多态位点百分比为 52.63%。见表 3。表 3 不同地区冷蒿居群的遗传多样性3.2.2 遗传多样性分析从表 3 可以看出，冷蒿居群总的 Nei 遗传多样性指数、Shannon 信息指数为 0.246 2 和 0.394 4。各独立居群的遗传多样性均低于总体冷蒿的遗传多样性。其中不同居群基因多样性指数(Nei s)范围在 0.134 40.239 5，
16、Shannon 指数的范围在 0.202 40.369 9，基因多样性与 Shannon 指数的结果完全相符。可以看出，通辽、锡林郭勒、呼和浩特 3 个地区，冷蒿的遗传多样性依次降低。3.2.3 冷蒿的遗传结构和基因流表 4 显示，在 3 个地区冷蒿居群总的基因多样度 Ht=0.238 1，其中存在于居群内的基因多样度 Hs=0.187 4，居群间的基因多样度 Dst(HtHs)=0.050 7。不同地区居群间的基因分化系数 Gst=0.212 9，即居群间遗传变异占居群总的遗传多样性的21.29%，说明冷蒿居群的遗传差异大部分存在于居群内。许多因子(包括时间、空间等方面，如居群大小、繁殖系统
17、、性比、世代长、世代重叠、基因流等)影响着自然植物的遗传变异程度，其中考虑较多的关键因子之一是基因流。根据 Gst，计算出 3 个地区的基因流Nm*=1.848 1，Wright13指出，如果 Nm*1，则由于遗传漂变可以导致居群间明显的遗传分化。那么，不同地区冷蒿居群的基因流的数值(1)说明居群间有基因的交流，且遗传分化不是由于遗传漂变产生的。表 4 不同地区冷蒿居群的 Ht、Hs、Gst、Nm*3.2.4 居群间的遗传距离居群间的遗传距离可以进一步说明居群间的遗传分化程度。从表5 中可以看到 3 个地区冷蒿居群的遗传距离很小，说明不同地区的冷蒿具有相近的遗传背景。图 3 是根据遗传距离，用
18、 UPMGA 方法得到的不同地区冷蒿的聚类图，图中冷蒿的 3 个居群中呼和浩特(H)与锡林郭勒(L)聚为一类，通辽(T)单独聚为一类。表 5 不同地区冷蒿居群遗传距离和遗传一致度4 讨论本实验是在前人对不同地区冷蒿药效差异分析的基础上，利用RAPD，探究冷蒿的遗传多样性。根据邹喻苹等14对 165 属 499 种植物等位酶数据统计的结果，物种水平的多态性应在 50%左右，居群水平的多样性应为 40%左右，Gst 应在 0.17 左右。崔光红等15在药用肉苁蓉的遗传多样性 RAPD 分析中根据肉苁蓉平均多态位点百分率 47.37%，2 个居群多态位点分别为 39.47%，35.53%，Gst=0
19、.2545，得出荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉的遗传多样性降低，已经处于极度低下状态的结论。而本研究中物种水平的多态性在 96.17%，居群水平所得多态性水平通辽(T)为76.08%、锡林郭勒(L)为 52.63%、呼和浩特(H)为 37.32%，Gst 为 0.212 9 均高于这些平均值，所以，冷蒿在物种水平和居群水平上都有着丰富的遗传多样性。冷蒿在北温带广泛分布;多年生小半灌木;风媒异花受粉;存在于演替的各个阶段。冷蒿有如此广泛的分布，所面临的环境差异大，个体和居群数目多，适应幅度大，基因交流频繁，因此维持遗传变异的能力强，产生新的遗传变异的机会也多，这都有利于其增加遗传多样性水平，并使之保持较
20、高的水平，高于高等植物平均遗传多样性水平(约 70%)16。 由于地理位置的不同，各种环境因子各有差异，这必然会影响不同地区居群的遗传多样性水平12，16，17。用 Nei s 指数、Shannon 指数分析，通辽遗传多样性最丰富，锡林郭勒盟次之，呼和浩特最少。这与植株所在的环境有关。通辽地区 41%的土地为沙沼，而且所用药材新鲜，样本量大，所以遗传多样性丰富。冷蒿作为一种风媒异花授粉的植物、在多水条件下不生存、在干燥的条件下，遗传多样性较丰富。锡林郭勒盟，常年大风，年均降雨少，因而遗传多样性丰富。呼和浩特地区因为降水量是 3 个地区中最高的，遗传多样性水平降低。目前，药材遗传多样性的研究多采
21、用新鲜植株。但考虑到进行药效分析和人们使用药材时多用干药材，因而本研究对呼和浩特和锡林郭勒两个地区的干药材进行遗传多样性分析。初步建立了较为合适的 DNA提取、RAPD-PCR 反应体系，并分析了 3 个地区冷蒿的遗传多样性水平，为进一步研究蒙药冷蒿的药效和遗传多样性的关系以及找到药效差异的分子遗传机制奠定基础，从而为今后冷蒿栽培，品种改良提供正确的方向。致谢：感谢中国农业科学院作物科学研究所孔秀英实验室的老师和研究生以及郝晨阳博士对数据分析的指导和帮助。【参考文献】1 占布拉, 陈世璜, 张 昊, 等. 冷蒿的特性和生态地理分布的研究J. 内蒙古农牧学院学报, 1999, 20(1): 1.
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