1、免疫荧光双标记技术检测胎盘 HBsAg抗HBs 复合物作者：王歆 ，徐德忠 ，刘蓬勃 ，李玉松 ，王素萍 【关键词】 肝炎病毒 关键词: 肝炎病毒，乙型;胎盘;抗原抗体复合物 摘 要:目的 探讨乙肝病毒（HBV）以何种形式感染胎盘滋养层细胞. 方法 通过免疫荧光双标记技术检测 12 例血清 HBsAg 阳性母亲的胎盘滋养层细胞 HBsAg-抗-HBs 复合物. 结果 血清学 HBsAg 阳性母亲胎盘滋养层细胞中存在 HB-sAg-抗-HBs 复合物. 结论 提示 HBV 可能通过 HBsAg与抗-HBs 结合成复合物的方式进入胞内，导致胎盘屏障的第一层细胞受到 HBV 感染. Keywords
2、:hepatitis B virus;placenta;antigen-antibody complex Abstract:AIM To find out which form Hepatitis B Virus（HBV）takes in the infection of the first layer cell of placenta barrier-trophoblast cells.METHODS HBsAg-anti-HBs complexes in HBsAg seropositive maternal placenta tissues were tested by double-l
3、abeling immunofluorenscence method visualized with laser scanning confocal microscope.RESULTS HBsAg-anti-HBs complexes were found mainly on tro-phoblast cells（TC）of HBsAg seropositive maternal placenta tissues.CONCLUSION HBsAg and anti-HBs are formed as HBsAg-anti-HBs complexes before entry into tro
4、phoblast cells，which may result in the infection of the first layer cell of placenta barrier. 0 引言 乙型病毒肝炎是严重危害我国人民健康的传染病.乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性的孕妇可将乙肝病毒（HBV）经胎盘传给胎儿，这种传播称为 HBV 的宫内传播.现在普遍认为，胎盘在 HBV 宫内感染中起重要作用，认为 HBV 是先感染胎盘然后才引起胎儿感染的，我室既往用免疫组织化学和原位杂交方法对 101 例血清学 HBsAg 阳性胎盘组织检测了 HB-sAg 和HBVDNA，其中滋养层细胞 HBsAg
5、 阳性率为 40.6%（41/101） ，发现 HBsAg主要分布于胞质1 .国外学者在 3 例 HBsAg 慢性携带者胎盘绒毛基质血管内、滋养层细胞等检测到 HBsAg2 .可见胎盘滋养层细胞受到HBV 感染已毋庸置疑，但 HBV 是如何进入滋养层细胞的确切机制国内外尚未见报导.本研究通过对胎盘组织 HBsAg-抗-HBs 复合物的检测，试图阐明 HBV 是以何种方式跨越胎盘屏障进入滋养层细胞，为进一步揭示其宫内传播机制提供依据. 1 材料和方法 1.1 材料 1997/1998 年太原市传染病院妇产科收集 HBsAg 阳性足月分娩产妇静脉血 35mL 及胎盘组织，静脉血分离血清后贮存于-2
6、0冰箱，统一进行 HBsAg，HBsAg 复查.用手术刀切取约 1.5cm1cm2cm 大小的胎盘组织（包括母面及胎儿面）浸入 40gL-1 多聚甲醛中固定后常规石蜡包埋.从以上收集的胎盘标本中选择 ABC 和免疫荧光组织化学检测为HBsAg 阳性的胎盘标本 12 例.鼠抗-HBs 购于武汉博士德生物工程有限公司（BioGenex 产品，克隆号:A34060259P，Cat.No:MU364-UC）;FITC 标记的 HBsAg 自制（HBsAg 购于北京医科大学肝病研究所，从 HBsAg 携带者血浆中提取，经浓缩后，用 FITC 进行标记）;生物素化兔抗鼠 IgG 购于博士德，产品编号:SA
7、1072，Avidin 标记的 Texas Red 购于基因公司（Molecular Probes 产品，Catalog No:A-2665）.用正常鼠血清代替鼠抗-HBs 及 FITC 标记的 HBsAg 作为抗体特异性对照;用 PBS 代替抗-HBs 及FITC 标记的 HBsAg 作为空白对照;另外用血清学检查 HBV 感染标记全阴性胎盘组织作为正常阴性对照. 1.2 方法 1.2.1 HBsAg 的检测 切片常规脱蜡（二甲苯、梯度乙醇）水化后，加入 150 稀释的鼠抗-HBs 单抗，4过夜.PBS 振洗后，再加入 1:50 稀释的生物素化的兔抗鼠 IgG3760min，最后加入 110
8、00 稀释的 Avidin 标记的 Texas Red，37孵育数小时，PBS 充分洗涤，用无荧光缓冲甘油封片后，直接在激光共聚焦显微镜（LSCM）上观察并拍照.所用 LSCM 型号为 Bio-RadMRC-1024，用于 Taxas Red 的激发波长为 568nm. 1.2.2 抗-HBs 的检测 切片同上脱蜡水化后，加入 120 稀释的 FITC 标记的 HBsAg.37孵育数小时，PBS 充分洗涤，激光共聚焦显微镜（LSCM）上观察并拍照，用于 FITC 的激发波长为 488nm. 1.2.3 HBsAg-抗-HBs 复合物的检测 切片经常规脱蜡水化后，加入 3molL-1 尿素，室温
9、 30min后，滴加 150/PBS 正常血清封闭液，室温 10min.滴加 150 稀释鼠抗-HBs，4过夜.PBS 振洗后，再加入 150 稀释的生物素化的兔抗鼠IgG3760min，最后加入 11000 稀释的 Avidin 标记的 Texas Red 和120 稀释的 FITC 标记的 HBsAg.37孵育数小时，PBS 充分洗涤，用无荧光缓冲甘油封片后，直接在激光共聚焦显微镜（LSCM）上观察并拍照. 2 结果 对血清学 HBsAg 阳性胎盘组织采用免疫荧光间接法检测 HBsAg，并在激光共聚焦显微镜上进行观察.红色荧光代表被检测的 HBsAg 阳性.采用免疫荧光直接法检测其抗-HB
10、s，绿色荧光代表抗-HBs 阳性.采用免疫荧光双标记技术检测 HBsAg-抗-HBs 复合物，除红、绿色荧光外，黄色荧光是HBsAg 和抗-HBs 的重叠色，即二者在同一位置，说明 HB-sAg 和抗-HBs 是以复合物的形式存在.观察发现胎盘滋养层细胞 HBsAg（Fig1） 、抗-HBs（Fig2） 、及 HBsAg-抗-HBs 复合物阳性（Fig35） ，阳性物质位于细胞质.HBV 感染标志全阴性胎盘作为正常阴性对照，未显示阳性染色信号，空白及替代对照也未显示阳性染色信号. 3 讨论 胎盘是胎儿生长和发育的基础，是胎儿与母体之间物质交换的场所，同时对病原微生物又具有屏障作用.我们近年来将
11、分子流行病学研究引入HBV 宫内感染的研究，用免疫组化和原位杂交方法检测血清 HBsAg 阳性产妇胎盘细胞 HBcAg 和 HBVDNA，发现胎盘各层细胞均存在 HBV 感染，而且从母面的蜕膜细胞到胎儿面的毛细血管内皮细胞 HBV 感染率有逐渐下降的趋势，HBsAg、HBcAg 和 HBVDNA 主要分布于胎盘细胞的胞质，偶见胞核和胞膜1 .重复研究得到了相似的结论.结合国外的研究结果 2 ，血清 HBsAg 阳性胎盘存在 HBV 感染已毋庸质疑.那么，HBV 又是以何种形式感染胎盘细胞并存在于胎盘组织的呢? 我们曾用直接免疫荧光组织化学法对 ABC 法检测为 HBsAg 阳性的胎盘组织和 H
12、BV 血清学感染标志全阴性胎盘检测抗-HBs，发现抗-HBs 阳性部位分布于绒毛滋养层和绒毛间质和蜕膜细胞，与以上检测的 HBsAg 的分布相一致，推测 HBsAg 与抗-HBs 很可能是以免疫复合物的形式沉积于这些细胞. 近年来在许多病毒对人体感染的作用机制研究中，发现了一种抗体依赖的病毒感染的增强作用，即非中和性抗体介导的病毒感染增强作用3 .有两种形式:一种是病毒与 IgG 抗体结合成复合物，经细胞表面的 Fc 受体介导，以内化方式进入胞内;另一种是包被了 IgM 抗体的病毒与补体受体结合，进而增加病毒对靶细胞的感染.无论何种方式，病毒感染靶细胞都是以抗原-抗体复合物的形式，那么，乙肝病
13、毒会不会也以此种方式感染胎盘细胞呢? HBV 进入人体后，可产生一系列针对病毒抗原成分的抗体，其中 IgG型占大多数.这些抗体与人血液中 HBV 的不同抗原相结合，形成多种抗原-抗体免疫复合物，并可进一步活化补体.HBsAg-抗-HBs 复合物就是其中的一种.研究发现，急性或慢性 HBV 感染患者体内，HBsAg-抗-HBs 复合物中抗-HBs 的主要亚型是 IgG1 和 IgG4，而恢复期患者血清中游离抗-HBs主要亚型是 IgG1 和 IgG3 4 .胎盘绒毛间隙充满母体血，绒毛滋养层细胞浸浴在 HBV 感染的母体血液中，从理论上讲，为 HBsAg-抗-HBs 复合物沉积于绒毛滋养层细胞提
14、供了条件，也是 HBV 侵入胎儿的关键部位. 我们应用免疫荧光双标记组织化学技术，采用共聚焦显微镜观察方法，检测血清 HBsAg 阳性产妇胎盘组织 HBsAg-抗-HBs 复合物，HBsAg 的检测用红色荧光显示，抗-HBs 用绿色荧光显示，若复合物存在，应呈黄色荧光.结果发现 HBsAg 和抗-HBs 以免疫复合物形式存在于绒毛滋养层和间质细胞，空白对照，替代对照及母亲血清 HBV 感染标志全阴性胎盘未发现荧光染色，说明所检测到的 HBsAg-抗-HBs 复合物非假阳性结果. 我们发现了胎盘在宫内传播中的作用，并提出了 HBV 宫内传播机制的假设5 ，即通过以下两条途径:除血源性途径外，还可
15、通过 HBV 在胎盘组织内的“细胞传递” （cell transmission）途径，即 HBV 可以从母体蜕膜细胞通过“逐层转移”至胎儿绒毛毛细血管内皮细胞，导致胎儿感染.为探明“细胞传递”的具体机制，本次研究采用双标免疫荧光组织化学法首先证实了胎盘滋养层细胞表面存在 HBsAg-抗-HBs 复合物，因而认为 HBV 感染滋养层细胞是以 HBsAg 与抗-HBs 结合成复合物的形式，为进一步揭示宫内传播机制提供了依据. 致 谢 太原传染病院妇产科白钢钻主任等协助收集标本;病理教研室李玉松教授在实验中给予指导;电镜室王春梅主任给予共聚焦技术上的大力协助. 参考文献: 1YanYP，Xu DZ，
16、Wang WL，Liu B，Liu ZH，Men K，Zhang JX，Xu JQ.The role of placenta in Hepatitis B virus intrauter-ine transmission J.Zhonghua Fuchanke Zazhi（Chin J Obstet Gynecol） ，1999;34（7）:392-395. 2Lucifora G，Calabro S，Carroccio G，Brigandi A.Immunocy-tochemical HBsAg evidence in placents of asmptomatic carrier moth
17、ers J.Am J Obstet Gynecol，1988;159:839-842. 3Liu PB.Antibody-dependent enhancement of virus infection J.Guowai Yixue Bingduxue Fence（Foreign Med Sci:Virol） ，2000;27（1）:29-32. 4Rath S and Devey ME.IgG subclass composition of antibody to HBsAg in circulating immune complexes from patients with hepatitis B infection J.Clin Exp Immunol，1998;72（1）:164-167. 5Xu DZ，YAN YP，XU JQ，Wang WL，Men K，ZHang JX，Liu B，Liu ZHH，Wang FSH，Jiang ML，CHen XH.A molecular epidemiology study on risk factors and mechanism of HBV in-trauterine transmission J.Zhonghua Yixue Zazhi（Natl Med J China） ，1999;79（1）:24-27.
