1、免疫印迹法检测 IKK, IB 和 NF【关键词】 喉肿瘤 【Abstract】 AIM: To detect the expression of IKK, IB and NFB in laryngeal carcinomas and to explore its significance for the genesis and development of carcinomas. METHODS: The expression of IKK, IB and NFB p65 in 20 cases of laryngeal carcinomas and 10 cases of normal l
2、aryngeal tissues was detected by Western blot technique. RESULTS: The expression of IKK and NFB p65 in laryngeal carcinoma tissues was higher compared with that in normal laryngeal tissues and the expression of IB was lower (P0.05). CONCLUSION: The expression imbalance of IKK, IB and NFB is closely
3、associated with the genesis and development of laryngeal carcinomas. 【Keywords】 laryngeal neoplasms; immunobloting; IKK; IB; NFB 【摘要】 目的：检测喉癌组织中 IKK, IB 和 NFB 的表达，并进而揭示其在肿瘤发生发展中的意义. 方法：采用免疫印迹法（Western blot）分析 20例喉癌标本和 10例正常喉黏膜标本中 IKK, IB, NFB p65的表达. 结果：喉癌组织中 IKK 和 NFB p65的表达水平明显高于正常组织， IB 表达水平明显低于正
4、常组织（P0.05）. 结论：IKK, IB 和 NFB 表达失衡与喉癌的发生发展有着密切关系. 【关键词】 喉肿瘤；免疫印迹法；IKB 激酶；IB；核因子 B 0 引言 核因子 B（nuclear factor kappa B, NFB）是近年来研究的热点，其激活参与炎症、细胞增殖、细胞凋亡等基因的凋节. NFB 和NFB 的抑制蛋白 IB 及 IB 激酶 IKK与肿瘤的发生发展关节密切，在多种肿瘤中存在异常表达1. IKK, IB 和 NFB 在喉癌中的表达情况国内外尚未见报道. 我们应用免疫印迹法，对 IKK, IB, NFB p65在喉癌中的表达进行了研究，探讨 IKK, IB, NF
5、B p65与喉癌发生发展的关系. 1 材料和方法 1.1 材料 收集重庆医科大学第一医院耳鼻咽喉科 200107/200207期中 20例（全部为男性）手术切除的喉癌组织及 10例正常喉组织标本，肿瘤切除后 30 min内采集喉癌组织，同时切取距肿瘤 2 cm以外的喉组织作正常对照组，立即置于液氮保存. 所有病例均经病理证实为鳞状细胞癌，并且未行放疗、化疗. 20 例喉癌组织按 UICC 1997年标准分期：期 4例、期 6例、期 9例、期 1例；肿瘤分化程度：级 8例、级 10例、级 2例；颈部淋巴结转移 3例. IB 抗体购自北京中山公司，IKK抗体、NFB p65抗体和 Western
6、blot发光试剂购自美国 Satus Cruzs公司. 1.2 方法 组织总蛋白的提取采用 Satus Cruzs公司方案. RIPA液裂解喉癌及正常喉组织，Bradford 法检测蛋白浓度，-70冻存. 以每泳道 60 g上样，经 SDSPAGE电泳后，电转至硝酸纤维膜，先各加入 IKK, IB和 NFB p65一抗，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，以 Western blot发光试剂检测杂交信号. 凝胶成像分析系统进行密度扫描；Image Master VDS Software软件分析蛋白区带；IKK, IB 和 NFB p65量用蛋白区带积分光密度值表示. 统计学处理：采用 SPSS 1
7、0.0统计学软件，结果用 xs表示，采用t检验. 2 结果 2.1IKK 的表达 Western blot检测结果显示喉癌组织 IKK 积分光密度值为 1887.63328.34，正常喉组织 IKK 积分光密度值为698.56103.85，两样本的 t检验，差异有显著性(P0.05, Fig 1）. 2.2IB 的表达 Western blot检测结果显示喉癌组织 IB 积分光密度值为 491.5482.85，正常喉组织 IB 积分光密度值为2033.09170.17，两样本的 t检验，差异有显著性(P0.05, Fig 2）. 2.3NFB p65的表达 Western blot检测结果显示
8、喉癌组织 NFB p65积分光密度值为 1775.87362.81，正常喉组织 NFB p65积分光密度值为 476.4253.00，两样本的 t检验，差异有显著性(P0.05, Fig 3）. 3 讨论 IKK, IB 和 NFB 是 NFB 信号传导通路的组成成分，在肿瘤的发生发展中起着关键作用，其参与癌变的机制是其可调控与细胞分化和细胞凋亡相关基因的表达，进而促进肿瘤细胞的分化，抑制肿瘤细胞凋亡. 在静息状态下， NFB 和 IB 以无活性形式存在于细胞质中. 当细胞受到某些细胞外信号刺激时，通过信号传导激活 IKK的上游激酶而促使 IKK活化，活化的 IKK通过对 IB 的磷酸化而使
9、IB 与 NFB 二聚体解离，致使 NFB 被激活并易位入核与靶基因的 B 位点结合，启动下游基因转录. IKK, IB 和 NFB 的表达失衡是一些疾病发生发展的重要原因之一，肿瘤的发生发展与它们表达失衡存在着更为密切的关系. 研究发现，在人结肠腺癌组织中，NFB 的亚单位 RelA(p65)的表达较结肠腺瘤、正常结肠黏膜明显增强，提示 NFB p65表达的增强在从低度结构不良的结肠腺瘤到结肠腺癌的转变中扮演了重要角色2. Nair等3的实验证实，NFB 的 DNA结合活性随着宫颈癌的恶性程度的增加而增加，而 IB 在宫颈癌组织中不能检测到，而在正常宫颈组织中能够检测到. Tamatani等
10、4的研究表明，在头颈部癌组织中，NFB 的结合活性和 IB 激酶 IKK的亚单位 IKK 的表达较正常组织明显增强，而 IB 明显减弱. 以上实验说明，NFB 信号传导通路在恶性肿瘤的发生发展中起到一定作用，在致癌因素作用下，活化的 IKK促进IB 的磷酸化、降解，使与 IB 相结合的 NFB 从二聚体解离，从而促进了肿瘤的发生、发展. 在本研究中，我们发现，在喉癌组织中 IKK 和 NFB p65的表达明显高于正常喉组织，IB 的表达明显低于正常喉组织. 我们的实验提示，IKK、IB 和 NFB 在喉癌的发生发展中可能扮演着重要的角色，其活化与喉癌的恶性潜能有着密切的关系，它有望成为喉癌治疗
11、的新靶点5. 【参考文献】 1 Karin M， Cao Y， Greten FR， et al. NFkappaB in cancer: From innocent bystander to major culpritJ. Nat Rev Cancer, 2002;2(4): 301-310. 2 Yu HG, Yu LL, Yang Y, et al. Increased expression of RelA/nuclear factorkappa B protein correlates with colorectal tumorigenesisJ. Oncology, 2003; 65
12、(1): 37-45. 3 Nair A, Venkatraman M, Maliekal TT, et al. NFkappaB is constitutively activated in highgrade squamous intraepithelial lesions and squamous cell carcinomas of the human uterine cervixJ. Oncogene, 2003; 22(1):50-58. 4 Tamatani T, Azuma M, Aota K, et al. Enhanced IkappaB kinase activity is responsible for the augmented activity of NFkappaB in human head and neck carcinoma cellsJ. Cancer Lett, 2001;171(2): 165-172. 5 Bharti AC, Aggarwal BB. Nuclear factorkappa B and cancer: Its role in prevention and therapyJ. Biochem Pharmacol, 2002; 64(56): 883-888.
