1、逆转录-聚合酶链反应法检测消瘤保肺丸对E-cad、-catenin 及 -catenin 表达的影响【摘要】 目的研究消瘤保肺丸对人肺癌 PG 细胞中 E-cad、-catenin 及 -catenin 表达的影响。方法采用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测 E-cad、-catenin 及 -catenin 表达的情况。随机分为四组，即消瘤保肺丸高剂量组、消瘤保肺丸低剂量组、对照组及空白组，分析电泳凝胶的灰度值。结果消瘤保肺丸高剂量组对 3 种分子的表达与空白组差异显著，(P0.01)。消瘤保肺丸低剂量组 -catenin、-catenin 表达与空白组差异显著，(P0.05);E-
2、cad 表达与空白组无显著差异，(P0.05)。在 -catenin 的表达与空白组差异显著，(P0.05)。结论消瘤保肺丸对人肺癌 PG 细胞的 E-cad、-catenin及 -catenin 的表达有明显影响，消瘤保肺丸对肺癌有一定的抑制作用，该实验为今后分子水平的进一步研究提供了依据。 【关键词】 逆转录-聚合酶链反应;消瘤保肺丸;E-cad、-catenin及 -catenin;人肺癌 PG 细胞上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)是维持上皮细胞形态及同种细胞间粘附连接的主要粘附分子。-连接素(-catenin)是 E-cadherin 连接细胞骨架所必需的成分，E-cadher
3、in 借助于 -catenin 连接在 E-cadherin 与 -catenin 之间1。大量的实验证实 E-cad/catenins 复合物介导细胞同质粘附而具有抑制肿瘤侵袭、转移的作用2。消瘤保肺丸中成药制剂，在临床用于肺癌已有多年，本篇通过 PCR 等相关手段研究消瘤保肺丸对 E-cadherin、-catenin 及 -catenin 表达水平的影响，以探究中药抗癌转移的作用机制。1 材料与仪器1.1 药物消瘤保肺丸，仪器由河南省中医院院内制剂室提供，批号：20070514;清肺化痰丸，昆明中药厂有限公司，国药准字 Z53020763，批号：080119。1.2 动物及瘤株 PG 细
4、胞(即人高转移性巨细胞肺癌细胞株)，由北京广安门医院提供;日本大耳白兔 8 只，购于郑州大学动物实验中心，动物合格证号：8cxk(豫)2005-2002。1.3 试剂 RPMI-1640 培养基，美国 Gibco 公司，编号 1313945;优级胎牛血清，天津 TBD 公司，编号 Df-1055;PCR 试剂盒，北京 Promega 公司，编号 m-7501;RT Fsk-100 试剂盒，日本 Toyoto 公司，编号76660C3;Trizol Reagent，美国 Gibco 公司，编号 1373341;DEPC 原液，Sanland-Chem International Inc，0532
5、B73;Goldview 染色剂，北京赛百盛公司，编号 Jun-04-2010。1.4 仪器二氧化碳培养箱 HF90 型，上海力新 HEAL FORCE;图像记录分析系统，大连 Jim-X Scientific，编号 D140;PCR GeneAmp System，美国 Applied Biosystems，编号 2700;电泳仪，北京市六一仪器厂，编号 DYY-6C。2 方法2.1 动物分组与模型建立2.1.1 动物分组 8 只健康日本大耳白兔，随机分为消瘤保肺丸高剂量药物组、低剂量药物组，清肺化痰丸对照组，空白组 4 组，每组 2 只，每组每天早晚各给药 1 次，10 ml/kg/次，其中
6、高、低剂量组分别相当于人等效剂量的 10，5 倍，空白组给以等量生理盐水，连续给药 3 d。2.1.2 动物模型建立空白组(每组每天早晚各灌胃生理盐水 1 次，10 ml/kg/次);对照组(每组每天早晚各灌胃 1 次，清肺化痰丸 1 g/kg);消瘤保肺丸高剂量组(每组每天早晚各灌胃 1 次，共消瘤保肺丸 1.5 g/kg);消瘤保肺丸低剂量组(每组每天早晚各灌胃 1 次，共消瘤保肺丸 3 g/kg)。2.2 药物制备实验用药剂量参考药物说明书。清肺化痰丸：实验时以纯净水配制成 10%的浓度供试;消瘤保肺丸：实验时以纯净水配制成 10%的浓度供试。2.3 细胞培养复苏 PG 冻存细胞，培养基
7、选用含 20% 优级胎牛血清的 RPMI-1640 培养基，隔日或每日换液 1 次，直至基本贴满下壁，细胞传代，每培养瓶中加 2 ml 0.25% 胰蛋白酶液使细胞脱壁，加入 8 ml 培养基，反复吹打后分入 5 ml 至新培养瓶。观察细胞生长状态良好，分别加入各组含药培养基，放 37 CO2 培养箱培养 48 h。2.4 引物设计特异性引物(E-cad、-catenin、-catenin)，采用“Premier Primer 5”软件，由北京赛百盛生物技术公司制作。2.5RNA 提取观察细胞基本贴满，PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次 5ml;加入 Trizol Reagent 1 ml (1
8、 ml/15 m2)，轻摇使 Trizol 充分接触瓶壁。将 Trizol Reagent 处理的细胞液转移至 0.1% DEPC 处理过的 1.5 ml EP管(已消毒)，室温静置 5 min，加入氯仿 0.2 ml，剧烈混匀 15 s，室温静置 23 min。低温离心机中，4下 12 000 r/min 离心 15 min，上清液中即含有所需之 RNA。取上清液至另一 1.5 ml EP 管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置 10 min，4下 12 000 r/min 离心 15 min。弃上清，加入 75% 冷乙醇 1 ml(即先加入 750 l 预冷无水乙醇，再加入250 l R
9、NA Free H2O)。颠倒混匀，清洗，悬浮沉淀。4下 9 000 r/min 离心 15 min，弃上清，室温晾干。将 RNA 溶于 30 l RNA Free H2O 中。2.6 逆转录反应(ReverTra Ace-TM)取 200l EP 管，依次加入RNase Free H2O 6 l,5RT Buffer 4 l,dNTP Mixture 2 l,RNase Inhibitor 1 l,Oligo(dT)20 1 l,RNA 5l,ReverTra Ace 1 l;所得总反应体系共 20l，混匀后瞬间离心 10 s，置 PCR 仪中 30 预热 10 min，温度依次调至：42
10、20 min,99 5 min,4 5 min;按此过程顺序为一个循环。置低温离心机中，瞬间离心。合成所得cDNA 于-80保存。2.7 聚合酶链式反应(PCR)取 200l EP 管，依次加入 cDNA 1 l，dNTP 1 l，Taq 酶 1 l，10PCR Buffer 5l，MgCl2 3 l，序列特异性上游引物 1 l，序列特异性下游引物 1 l，-actin 上游引物(600bp)1l，-actin 下游引物(600bp)1 l，RNA Free H2O 35 l。所得反应体系共 50 l，混匀后瞬间离心 10s。根据引物的不同，退火温度不同，如下：E-cadherin 52;-c
11、atenin 50;-catenin 53;置 PCR 仪中温度依次调至： 94 2 min(预变性)，94 30s(变性 )，5053 30 s(退火)，72 2 min(延伸)，72 6 min(总延伸)，4 。第 2，3，4 步按顺序三步为一个循环，共进行32 个循环。扩增所得 DNA 于-80保存。2.8 凝胶电泳取琼脂糖 0.26 g 放入一干净三角烧杯中，加入 RNA Free H2O 11.7 ml、10TBE 缓冲液 1.3ml，共 13 ml，将三角烧杯置于微波炉中，中火加热，见有气泡出现随即停止加热，反复 78 次，待琼脂糖完全溶解且无气泡产生时，置常温下冷却至稍烫手。带一
12、次性手套，加入 EB 染色剂 2 l，摇匀。迅速将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置 30 min。取 10TBE 缓冲液 6 ml，配成 60 ml 溶液加入电泳槽中，将凝胶完全淹没于电泳槽液体中，凝胶的孔朝向电泳槽负极。取加样缓冲液(Loading Buffer)1 l 滴于干净塑料手套上，滴加PCR 产物 DNA 8 ml 与 1 l Loading Buffer 混匀，加入凝胶的孔中;加入 PCR Marker 5ml 于凝胶另一孔中。点样顺序为 PCR Marker、消瘤保肺丸高剂量组、消瘤保肺丸低剂量组、清肺化痰丸组、空白对照组。接通电源调至电压 90V，电流 300
13、 mA，30 min。将凝胶置于图像记录分析系统中观察电泳荧光情况，拍照记录，应用加拿大 Glyko 公司 BandScan 5.0 软件分析，计算目的条带与 -actin 条带的灰度值之比。见图 1 及表 1。 A-消高组 B-消低组 C-清肺组 D-空白组图 1 粘附分子在 PG 细胞中各组电泳结果表 1 电泳凝胶的灰度值之比2.9 统计采用 SPSS 13.0 统计软件处理，方法选用 One-Way ANOVA检验。3 结果消瘤保肺丸高剂量组对 3 种分子的表达与空白组差异显著，P 0.01。消瘤保肺丸低剂量组 -catenin、-catenin 表达与空白组差异显著，P 0.05;E-
14、cadherin 表达与空白组无显著差异，P 0.05。清肺化痰丸组大多与空白组无显著差异，只在 -catenin 的表达与空白组差异显著，P 0.05。4 讨论粘附是肿瘤转移过程中的一个关键环节。肿瘤细胞表面粘附分子与肿瘤的侵袭、转移密切相关，通过表面粘附分子与细胞外基质或细胞等的配体相结合，启动了细胞内各种信号通路，同时也改变了肿瘤细胞的一些特性。孙宏新等3研究发现益肺清化膏可有效地提高 E-cad 的表达，降低 CD44v6 的表达水平。本实验结果表明消瘤保肺丸对粘附分子在人 PG 肺癌细胞中的表达有显著影响。对 E-cadherin 的影响比较明显，在空白组表达相对消瘤保肺丸高剂量组降
15、低，说明 E-cadherin 的表达与消瘤保肺丸高剂量作用成负相关，而 -catenin、-catenin 则与消瘤保肺丸高剂量作用成正相关。通过与空白组比较消瘤保肺丸对各个分子表达的影响较大，以高剂量作用更为明显;清肺化痰丸组 -catenin 的表达与空白组有显著差异，说明该药中与消瘤保肺丸的化痰类药物可能对肺癌细胞有一定作用。中成药消瘤保肺丸的干预作用在细胞实验中有所体现，我们通过对细胞进行干预，在 RT-PCR 的各个步骤，形成具有中药干预效应的肺癌细胞 DNA，其表达效果与正常不同。细胞生长和增殖过程包括转录、逆转录的过程，是合成 DNA 的重要方面，由此可知，消瘤保肺丸在抗肿瘤侵
16、袭和转移的过程对 DNA 合成有一定影响。发挥中医药抗肺癌转移的优势，加强复方、验方的分子生物学水平研究，对指导今后临床的用药有重要意义。【参考文献】1Jou T, Stewart DB, Stappert J, et al.Gentic and bio-chemical dissection of protein linkages in the cadherin-catenin complexJ. Proc Natl Acad Sei,1995,92(11):5067.2杨剑锋，廖粤军.E-cadherin/catenins 与肿瘤发生、侵袭及转移 J.南华大学学报医学版，2002，30(4)：392.3孙宏新，蒋士卿，朴炳奎.益肺清化膏含药血清对肺癌细胞株的抑制作用 J.中医研究，2005，18(10)：12.
