胚胎干细胞分化为表皮样细胞的基因表达谱差异.doc

上传人:99****p 文档编号:2027553 上传时间:2019-03-29 格式:DOC 页数:11 大小:37.50KB
下载 相关 举报
胚胎干细胞分化为表皮样细胞的基因表达谱差异.doc_第1页
第1页 / 共11页
胚胎干细胞分化为表皮样细胞的基因表达谱差异.doc_第2页
第2页 / 共11页
胚胎干细胞分化为表皮样细胞的基因表达谱差异.doc_第3页
第3页 / 共11页
胚胎干细胞分化为表皮样细胞的基因表达谱差异.doc_第4页
第4页 / 共11页
胚胎干细胞分化为表皮样细胞的基因表达谱差异.doc_第5页
第5页 / 共11页
点击查看更多>>
资源描述

1、胚胎干细胞分化为表皮样细胞的基因表达谱差异张仁礼 刘彩霞 孟锦绣 闻安民 张丽丽 韩冬【摘要】 【目的】用全基因表达谱芯片技术筛选小鼠胚胎干细胞(ESC)定向分化为表皮样细胞(ELC)的差异表达的基因并对其进行分析,以进一步阐明 ESC 分化为 ELC 的分子机制?【方法】 利用人羊膜建立体外诱导体系,将小鼠 ESC 诱导定向分化为 ELC,做 3 次生物学重复,分别取未分化的 ESC 和诱导分化的 ELC 提取总 RNA 进行扩增?Cy3 标记,与NimbleGen 135k 小鼠全基因表达谱芯片(含 44170 个基因)杂交,荧光扫描,筛选出差异表达基因,并进行 GO 分析和 pathwa

2、y 分析,用实时定量 PCR对结果进行验证?【结果】 芯片筛选结果显示,分化后的 ELC 与 ESC 间的差异表达的基因多达 4856 个(Cut off:2)?基因本体(GO)分析显示与生物学过程相关的差异表达基因最多的是细胞过程,1931 个;与亚细胞组分(CC)相关的差基因中最多的是细胞和细胞组分相关基因,2391 个;与分子功能相关的差异基因中最多是的结合功能(binding)基因,1869 个?Pathway 分析显示,与 DNA 复制通路相关的差异基因有 23 个;与蛋白酶体通路相关的 24个;剪接体通路相关有 47 个;细胞周期相关的有 44 个?【结论】 ESC 体外诱导定向分

3、化为 ELC 过程中,基因表达谱发生了巨大的变化,提示细胞分化是一个众多基因参与的复杂的生物学过程,这些基因在分化过程所起的作用和作用机制尚需大量的实验研究阐明? 【关键词】 全基因组表达芯片 ; 胚胎干细胞; 表皮样细胞; GO 分析; Pathway 分析Abstract: 【Objective】 To screen and analyze different expressed genes between mouse embryonic stem cells (ESC) and their differentiated epidermal-like cells (ELC) with th

4、e whole genomic expression profile chip, and explore the molecular mechanisms of differentiation further.【Methods】 Mouse ESC was induced differentiation into ELC in vitro by human amnion repeated for three times. Total RNA of ESC and ELC was extracted, and then amplified by RT-PCR. The product cDNA

5、was labeled with Cy3 and hybridized on NimbleGen 135k mouse whole gene chip (containing 44, 170 genes). Fluorescence scanning, Gene Ontology (GO) and pathway analysis were used to screen the different expressed genes. The analytic result was validated by Real-time Quantitative PCR. 【Results】 A total

6、 of 4,856 genes showed differentially expressed between ESC and ELC (Cut off: 2). GO analysis showed that the differential expressed genes between ESC and ELC mainly involved cellular process (CP) genes of 1931, Cell/Cell part genes of 2391,and binding function genes of 1869, which belong to biologi

7、cal process (BP), cellular component (CC), and molecular function (MF), respectively. The pathway analysis showed that the differential expressed genes mainly involved genes related to DNA replication, proteasome pathway, spliceosome pathway, and cell cycle with the number of 23, 24, 47, and 44, res

8、pectively. 【Conclusion】 The change of expression profile between ESC and ELC indicated that large variety of genes were involved in this complex cellular differentiation process, and how these gene worked and co worked to regulate the differentiation procedure need further investigations.Key words:

9、whole genome expression chip; ES cells; epidermal-like cells; GO analysis; pathway analysis胰岛素抵抗不仅是 2 型糖尿病的发病基础,更是贯穿多种代谢相关疾病的共同病理生理基础?胰岛素抵抗加速了 2 型糖尿病的发生和发展,也增加了患心血管系统疾病的危险性1?因此,如何防治胰岛素抵抗十分重要?最近的调查表明,白藜芦醇(resveratrol,RSV)对高脂诱导的胰岛素抵抗综合征2具有保护作用,但分子机制仍不清楚?骨骼肌是机体主要的胰岛素靶器官,胰岛素介导的葡萄糖摄取,75%以上由骨骼肌细胞负责3?我们以往的

10、研究表明,雌激素可通过上调骨骼肌细胞微囊蛋白-3(caveolin-3,CAV-3)的表达,促进葡萄糖摄取4?已知 RSV 的分子结构和药理性质与雌二醇类似,所以它拥有雌激素的许多作用5?因此,我们推测,CAV-3 可能参与白藜芦醇对胰岛素抵抗影响过程?本研究在高脂诱导的胰岛素抵抗模型上,探讨 RSV 补充对骨骼肌细胞 CAV-3 表达及葡萄糖摄入的影响及其机制?1 材料与方法1.1实验动物与试剂200250 g 的清洁级雌性 SD 大鼠(由中山大学实验动物中心提供)?白藜芦醇(resveratrol,RSV)?考马斯亮蓝?Tris?亮肽素(leupeptin)?抑肽酶(aprotinin)?

11、苯甲基磺酰氟(PMSF)购自 Sigma 公司?Caveolin-3?GLUT4 和 -actin 抗体为 Santa Crus 公司产品?2-脱氧-3H葡萄糖购自 Amersham 公司?其它试剂为国产分析纯?大鼠在 232 ,12 h 光/暗周期循环(早 7 点开始给予光照)条件下饲养?饲养 1 周后在乙醚麻醉下切除大鼠双侧卵巢?2 周恢复期后,大鼠随机分为 3 组(每组 68 只),正常饮食组(NORM),给予正常饮食?高脂饮食组(HFD,高脂高糖饲料配制方案:10.0%猪油,20.0%葡萄糖,2.5%胆固醇,1.0%胆酸和 66.5%常规饲料)和高脂饮食加白藜芦醇干预组(HFD+RSV

12、,RSV 每天 10 mg/kg)?各组饲养共 16 周?1.2代谢参数的测量在给予不同的饮食喂养 16 周后,大鼠禁食过夜(16 h),经尾静脉采集血液样本?空腹血糖使用 LIFESCAN 单键超血糖仪(强生公司,美国)测定?空腹血清胰岛素使用超灵敏大鼠胰岛素 ELISA 试剂盒(Mercodia AB,瑞典乌普萨拉)测定?然后按照 2 g/kg 的剂量腹腔注射葡萄糖溶液进行腹腔内糖耐量试验(IPGTT),分别于注射后 0,15,30,60,90 和 120 min 测量血糖?1.32-脱氧-3H葡萄糖的摄取分离得到比目鱼肌,迅速放入持续灌注体积分数 95%O2 和 5% CO2的 KRB

13、缓冲液(pH 7.4,8 mmol/L 葡萄糖)37 孵育 60 min?随后,肌肉组织分别在有胰岛素(100 nmol/L)和无胰岛素的 KRB 缓冲液中孵育 30 min?接着使用 KRB 缓冲液冲洗肌肉组织,并在含有 3.7104 Bq 2-脱氧-3H葡萄糖的 2 mL KRB 缓冲液中 37 孵育 30 min?取出组织,使用无同位素标记的 KRB 缓冲液冲洗,加 1 mmol/L 的 NaOH 作用 2 h?使用放射性液体闪烁计数器测得 CPM 值?1.4免疫印迹将全细胞裂解液或质膜放入 10%的 SDS-PAGE 中分离,并在含有 200 mL/L 甲醇的 Tris-甘氨酸缓冲液中

14、转移至 PVDF 膜(Amersham),PVDF 膜用TBST 洗涤,10%脱脂牛奶封闭 1 h,并与一抗(CAV-3,GLUT4 和 -actin)孵育?之后用 TBST 缓冲液清洗 PVDF 膜,用耦合辣根过氧化物酶标记的二抗孵育 1 h,并使用增强化学发光试剂盒(Amersham)显色?1.5 统计分析运用 SPSS 13.0 软件进行统计分析,数据均以平均值标准差表示?采用单因素方差分析,组间多重比较使用 SNK-T 检验?检验水准 =0.05?2 结 果2.1白藜芦醇对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗起保护作用如图 1A,B 显示,经过 16 周的不同饮食,高脂饮食组相比正常饮食组,其空腹

15、血糖和胰岛素浓度显著上升;而给予白藜芦醇后,明显抑制了血糖和胰岛素浓度的上升?同时通过计算胰岛素敏感指数(ISI),ISI=l/(空腹血糖空腹胰岛素),证实了 ISI 在高脂饮食组明显下降,补充白藜芦醇能逆转这种下降?此外,我们通过 IPGTT 试验表明,与正常饮食组相比,高脂饮食组注射葡萄糖 30 min 血中的葡萄糖浓度明显升高,白藜芦醇处理组能明显降低注射葡萄糖 60 min 后的血糖浓度(图 1C)?以上结果表明,对已摘除双边卵巢的大鼠给予白藜芦醇能够改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗?2.2 白藜芦醇增加胰岛素刺激的骨骼肌葡萄糖摄取接下来,我们探讨了在离体的比目鱼肌中白藜芦醇对葡萄糖摄入所

16、起的作用?如图 2 所示,各组比目鱼肌基础状态下葡萄糖摄取量无显著差异?高脂饮食引起骨骼肌胰岛素刺激下的葡萄糖摄取量显著下降,而补充白藜芦醇后能使葡萄糖摄取量上升,表明白藜芦醇能促进骨骼肌摄取葡萄糖?2.3白藜芦醇促进 GLUT4 向细胞膜转移胰岛素刺激下的 GLUT4 转移至细胞膜是调节葡萄糖摄入的关键步骤6?因此我们下一步研究在胰岛素刺激的情况下,白藜芦醇对骨骼肌中GLUT4 蛋白的影响?如图 6 所示,不论是否有胰岛素的刺激情况下,不同饮食的各组比目鱼肌中 GLUT4 的总量是不变的(图 3A)?但是,在胰岛素刺激的情况下,HFD 组骨骼肌细胞膜中所含 GLUT4 蛋白明显下降,而给予白

17、藜芦醇能抑制这种下降(图 3B),这表明了白藜芦醇通过影响 GLUT4 向细胞膜的转运而不是 GLUT4 的表达,来影响葡萄糖的摄入?2.4 白藜芦醇上调骨骼肌中 CAV-3 蛋白的表达研究表明 CAV-3 能影响 GLUT4 的转移,对骨骼肌胰岛素抵抗形成具有重要作用?我们接下来探讨白藜芦醇的胰岛素抵抗保护作用是否与 CAV-3 有关?免疫印迹结果显示,HFD 抑制 CAV-3 蛋白表达,而白藜芦醇能逆转HFD 对 CAV-3 蛋白表达的影响(图 4)?3 讨 论我们通过检测空腹血糖?胰岛素浓度,计算胰岛素敏感指数以及腹腔葡萄糖耐量试验证实,补充白藜芦醇可以改善高脂诱导的胰岛素抵抗?进一步离

18、体骨骼肌葡萄糖摄入实验提示,白藜芦醇的胰岛素抵抗保护作用与其促进葡萄糖摄入有关?免疫印迹结果显示,白藜芦醇能够上调骨骼肌CAV-3 蛋白表达,促进 GLUT4 向骨骼肌细胞膜转移?以上结果显示,白藜芦醇的胰岛素抵抗保护作用,与其上调骨骼肌 CAV-3 蛋白表达,促进 GLUT4转运,加快葡萄糖转运有关?白藜芦醇是一种植物雌激素,它在分子结构上与雌激素相近,可与雌激素受体相互作用5?最近的多个研究发现,对绝经后高脂饮食的妇女进行随机分组后,雌激素治疗能降低糖尿病的发病风险7-9?因此在目前的研究中,我们首次采用双侧卵巢切除的大鼠来研究白藜芦醇的作用与其在影响葡萄糖摄取和胰岛素抵抗中的机制?我们的

19、实验结果表明,将白藜芦醇提供给双侧卵巢切除的大鼠后,可以抑制血清葡萄糖的升高与胰岛素浓度,说明了白藜芦醇可以延缓胰岛素抵抗的发展?这个结果与之前研究显示白藜芦醇可以在 2 型糖尿病病人10和高脂饮食的大鼠2中增加胰岛素敏感性相一致?由于雌激素替代疗法有可能引起乳腺及子宫的癌变,因此,拟雌激素类的药物白藜芦醇就有可能用于临床上治疗 2 型糖尿病,尤其是绝经后高脂饮食的妇女?骨骼肌是机体摄取葡萄糖最主要的组织之一,葡萄糖跨膜转运是骨骼肌利用葡萄糖的首要步骤?葡萄糖跨膜进入骨骼肌需要细胞膜上 GLUT4的协助扩散,GLUT4 在维持体内葡萄糖自稳态中起着非常重要的作用6?我们的结果显示,白藜芦醇处理

20、后能够增加骨骼肌的葡萄糖转运,提示白藜芦醇可能对 GLUT4 具有作用?进一步实验结果显示,白藜芦醇对于骨骼肌总 GLUT4 的表达没有影响,但是却能够增加细胞膜上的 GLUT4 的含量?提示白藜芦醇促进骨骼肌葡萄糖摄入的主要原因是促进 GLUT4 转位至细胞膜?是哪种因素导致 GLUT4 的转移增加?目前研究表明细胞表面结构微囊(caveolae)对葡萄糖转运过程具有重要的调控作用,胰岛素受体和GLUT-4 就位于微囊上?CAV-3 是骨骼肌细胞膜表面微囊的关键结构蛋白,与葡萄糖的转运密切相关?研究显示,CAV-3 基因敲除的小鼠表现出骨骼肌的胰岛素抵抗11-12,同时在胰岛素刺激情况下,G

21、LUT4 在微囊中表达升高13?我们最近的研究表明了雌激素可以通过上调骨骼肌细胞内 CAV-3表达来促进葡萄糖的摄取4?因此我们假设,白藜芦醇可能通过上调 CAV-3 的表达,促进 GLUT4 向细胞膜转移,从而促进葡萄糖的摄入?免疫印迹实验证实与其他两组相比,白藜芦醇处理组 CAV-3 的表达明显增加,表明白藜芦醇可以促进 CAV-3 蛋白表达?但白藜芦醇是通过何种途径,如转录?翻译还是降解途径来增加 CAV-3 蛋白表达还需进一步细胞实验来证实?此外有研究结果表明,在糖尿病心肌病大鼠心肌细胞内,白藜芦醇可以促进CAV-3 与 GLUT4 相互作用,通过 AMPK/Akt/eNOS 信号通路

22、诱导 GLUT4 向细胞膜转移14?因此,本研究初步提示,白藜芦醇可通过上调 CAV-3 表达,促进与 GLUT4 相互作用来增加葡萄糖转运?综上所述,我们首次在双侧卵巢切除大鼠模型上证实,白藜芦醇可以改善高脂诱导的胰岛素抵抗?白藜芦醇的保护作用与其上调骨骼肌 CAV-3 蛋白表达,促进 GLUT4 向细胞膜转移,改善骨骼肌葡萄糖摄入有关?本研究为临床上使用白藜芦醇治疗绝经后 2 型糖尿病妇女提供了初步的实验依据?【参考文献】Reaven GM. Pathophysiology of insulin resistance in human diseaseJ. Physiol Rev, 1995

23、, 75(3): 473-486.Deng JY, Hsieh PS, Huang JP, et al. Activation of estrogen receptor is crucial for resveratrol-stimulating muscular glucose uptake via both insulin-dependent and -independent pathwaysJ. Diabetes,2008,57(7):1814-1823.DeFronzo RA, Jacot E, Jequier E, et al. The effect of insulin on th

24、e disposal of intravenous glucose. Results from indirect calorimetry and hepatic and femoral venous catheterizationJ. Diabetes, 1981, 30(12): 1000-1007.Mu P, Tan Z, Cui Y, et al. 17-beta-Estradiol attenuates diet-induced insulin resistance and glucose intolerance through up-regulation of caveolin-3J

25、. Ir J Med Sci, 2011, 180(1): 221-227.Bowers JL, Tyulmenkov VV, Jernigan SC, et al. Resveratrol acts as a mixed agonist/antagonist for estrogen receptors alpha and betaJ. Endocrinology, 2000, 141(10): 3657-3667.Bryant NJ, Govers R, James DE. Regulated transport of the glucose transporter GLUT4J. Nat

26、 Rev Mol Cell Biol, 2002, 3(4): 267-277.Rossi R, Origliani G, Modena MG. Transdermal 17-beta-estradiol and risk of developing type 2 diabetes in a population of healthy, nonobese postmenopausal womenJ. Diabetes Care, 2004, 27(3): 645-649.Andersson B, MattssonLA, Hahn L, et al. Estrogen replment ther

27、apy decreases hyperandrogenicity and improves glucose homeostasis and plasma lipids in postmenopausal women with noninsulin-independent diabetes mellitusJ. J Clin Endocrinol Metab, 1997, 82(2):638-643.Margolis KL, Bonds DE, Rodabough RJ, et al. Effect of oestrogen plus progestin on the incidence of

28、diabetes in postmenopausal women: results from the Womens Health Initiative Hormone TrialJ. Diabetologia, 2004, 47(7): 1175-1187.Brasnyo P, Molnar GA, Mohas M, et al. Resveratrol improves insulin sensitivity, reduces oxidative stress and activates the Akt pathway in type 2 diabetic patientsJ. Br J N

29、utr, 2011, 106(3): 383-389.Capozza F, Combs TP, Cohen AW, et al. Caveolin-3 knockout mice show increased adiposity and whole body insulin resistance, with ligand-induced insulin receptor instability in skeletal muscle J. Am J Physiol Cell Physiol, 2005, 288(6): C1317-C1331.Oshikawa J, Otsu K, Toya Y, et al. Insulin resistance in

展开阅读全文
相关资源
相关搜索

当前位置:首页 > 学术论文资料库 > 毕业论文

Copyright © 2018-2021 Wenke99.com All rights reserved

工信部备案号浙ICP备20026746号-2  

公安局备案号:浙公网安备33038302330469号

本站为C2C交文档易平台,即用户上传的文档直接卖给下载用户,本站只是网络服务中间平台,所有原创文档下载所得归上传人所有,若您发现上传作品侵犯了您的权利,请立刻联系网站客服并提供证据,平台将在3个工作日内予以改正。