1、帕金森病病人 USP24 基因外显子 3968 突变筛查作者：莫晓云 迟静薇 李小平 鹿丽娜 郭辉 李薇 凌捷 许小娟 谭洁琼 胡正茂 唐北沙 夏昆 【摘要】 目的 对帕金森病(PD)病人泛素 特异性蛋白酶 24(USP24)基因的外显子(exon)3968 进行突变筛查，以进一步了解 USP24 基因是否为 PD 的致病基因。方法 对中国湖南省 92 例散发 PD 病人 USP24 基因的 exon3968 通过 PCR 产物直接测序法进行突变筛查。结果 在exon3968 中未见任何碱基变异，在外显子 内含子交界区检测出 11 种变异，其中 3 种为已知多态(rs6588545、rs120
2、31876 和 rs10493176)，位于 exon59 的 c.7078+22 ag 变异仅在 1 例以强直为主要临床症状的早发男性 PD 病人中存在，在 95 例正常人中不存在此变异。结论在湖南地区的中国人群中，USP24 基因位于 exon3968 的基因突变可能在 PD的发病机制中不起主要作用。 【关键词】 帕金森病;USP24 基因;突变 ABSTRACT Objective To screen the exon39-68 of USP24 gene in patients with Parkinson disease (PD) and further understand whe
3、ther it is the cause of the condition. Methods Mutation screening of exons39-68 of USP24 was undertaken in 92 sporadic PD patients of Hunan. Results No any basic variations were detected in exons39-68; 11 variants were identified in the exonintron boundaries, in which, three of them were known polym
4、orphisms (rs6588545, rs12031876 and rs10493176). The mutation locating at c.7078+22 ag of exon59 was found in only one earlyonset male patient with main clinical symptom of stiffness, this variation was not found in 95 normal persons. Conclusion The mutation locating in exon39-68 of USP24 gene seems
5、 not to play a principal role in pathogenesy of Parkinson disease in Chinese population of Hunan region. KEY WORDS parkinson disease; USP24 gene; mutation 帕金森病(PD)是一种常见神经退行性疾病，遗传因素是其重要致病原因，迄今已定位了 16 个 PD 遗传易感位点，泛素 特异性蛋白酶24(USP24)基因位于 PD 的 PARK10 遗传易感位点1。LI 等2采用 25 个单核苷酸多态(SNP)对 PD 病人 USP24 基因进行病例 对照
6、研究，发现其中 6 个 SNP 在病人组与对照组间存在显著差异。尽管遗传学研究发现USP24 基因可能参与 PD 的发病，但现有的研究仅用 USP24 基因相关的SNP 在 PD 病人与正常人间做关联分析，并未在 PD 病人中对 USP24 基因进行突变筛查。本研究首次在 PD 病人中对 USP24 基因的部分外显子(exon3968)进行突变筛查,进一步分析 USP24 基因是否参与 PD 的发生。1 对象与方法 1.1 对象 1.1.1 PD 病人组 来自中国湖南省的汉族散发 PD 病人 92 例，由中南大学湘雅医学院神经内科唐北沙教授课题组收集，所有病人均经过至少2 名经验丰富的神经内科
7、医生严格的神经系统检查，诊断严格依据 1992年英国脑库原发性 PD 诊断标准3。92 例病人中，男 53 例，女 39 例;年龄为 1870 岁，平均(53.1414.96)岁;起病年龄为 1368 岁，平均(48.4315.04)岁;病程平均为(4.33.2)年。其中 41 例为早发性 PD，起病年龄50 岁;51 例为迟发性 PD，起病年龄50 岁。82.61%的病人存在震颤症状，79.35%的病人存在肌强直症状，40.22%的病人临床上出现姿势反射受损，59.78%的病人存在运动过缓表现。其中 33 例病人临床表现以震颤为主，24 例临床表现以强直为主。所有病人均在用药前采用 Hoeh
8、nYahr scale score 分期(HoehnYahr) 以及 PD 运动总分评级量表(UPDRS )来评估病人的病情严重程度及运动系统受损状况，本组病人的平均 HoehnYahr 评分为(2.340.87)分，平均 UPDRS 评分为(27.2715.43)分。在早发 PD 病人中，Parkin、PINK1 与 DJ1 基因均无突变(结果来源于唐北沙教授课题组)。 1.1.2 正常对照组 95 例，分别由医学遗传学国家重点实验室及中南大学湘雅医院收集。其中男 50 例，女 45 例;平均年龄为(52.1713.32)岁。性别、年龄、居住地、民族分布均与 PD 病人组相匹配。 1.2 方
9、法 1.2.1 外周血 gDNA 抽提 常规采集两组外周静脉血 10 mL，受检者均签署知情同意书。常规苯酚 氯仿法抽提外周血淋巴细胞 gDNA。 1.2.2 引物设计 对 USP24 基因 exon3968 以及这些外显子与内含子的交界区进行 PCR 扩增。采用 Primer 3.0 在线软件(http:/wwwgenome.wi.mit.edu/cgibin/primer/primer3.cgi/) 设计相应的 PCR 引物(序列见表 1)，引物由上海博亚生物技术有限公司合成。表 1 USP24 基因突变检测引物序列外显子正向引物反向引物 1.2.3 PCR 反应条件 采用热启动 PCR
10、反应程序在 10 L 反应体系中扩增各对引物，反应体系如下： 5106 U/L 的 hotstar polymerase (Qiagen 公司)0.25 L，10 mmol/L dNTPs 0.2 L，30 mg/L 引物每条1.0 L ，30 mg/L DNA 模板 1.0 L，10Buffer 1.0 L，Q Buffer 2.0 L，MgCl2 0.5 L，补去离子水至 10 L。多数引物的 PCR 反应程序为：第一相循环，95 预变性 15 min，94 变性 50 s, 65 退火 40 s，72 延伸 50 s，循环 6 次，每个循环退火温度下降 1 ;第二相循环，94 变性 50
11、 s，60 退火 40 s，72 延伸 50 s，循环 25 次，72 延伸 5 min。取 PCR 产物 2.0 L 用 60 g/L 聚丙烯酰胺凝胶电泳40 min，并银染检测，对扩增特异性好的 PCR 产物用虾碱性磷酸酶和核酸外切酶(Fermant 公司)37 酶切 90 min, 80 15 min 灭活虾碱性磷酸酶和核酸外切酶，将处理后的 PCR 产物使用 3100 基因分析仪(ABI 公司)进行测序。测序结果用 DNAStar 软件中的 SeqMan 程序与参照序列(Genebank accession number：NM_015306.2)进行比对分析。 1.3 统计学分析 使用
12、 SPSS 13.0 统计学软件包中的 Fishers exact test 分析等位基因频率和基因型频率在两组间的差别，以 P0.05 为差异具有显著性。 2 结 果 在 30 个外显子(exon3968)中未发现任何碱基变异，仅在外显子内含子交界区检测到 11 种变异，见表 2。其中，位于 exon57 的c.6882+71 at，位于 exon59 的 c.697639 ct 及位于 exon65的 c.752718 ag 的 3 个变异均为 dbSNP 数据库中已报道的 SNP，其SNP 分别是 rs6588545、rs12031876 和 rs10493176，其余变异均为 dbSN
13、P数据库中未报道的变异。所有变异或多态在病人中均以杂合状态出现。PD 病人中这 3 个位点的基因型及等位基因频率与 dbSNP 数据库报道的正常人的基因型及等位基因频率并没有差别(见表 3)。位于 exon59 的c.7078+22 ag 变异仅在 1 例以强直为主要临床表现的早发男性 PD 病人中检测到，在 95 例正常人中并未发现此变异。 3 讨 论 尽管 PD 的发病机制还不清楚，但目前认为遗传因素与环境因素的共同作用导致 PD 的发生。迄表 2 PD 病人中 USP24 基因 exon3968 突变检测结果外显子变异 dbSNP 数据库录入号 变异频率表 3 PD 病人与正常人中 US
14、P24 基因 rs6588545、rs120 今，在基于家系连锁分析的基础上已定位了 16 个 PD 遗传易感位点，克隆了 11 个 PD 致病基因，如：SNCA4、Parkin5、LRRK26、Pink17以及 ATP13A28 等。 已有研究结果证实，USP24 基因位于 PARK10 位点9。由于 USP24 基因是泛素 特异性蛋白酶家族的成员，具有将多聚泛素从靶蛋白上移走，防止靶蛋白被蛋白酶降解的功能，而蛋白酶解及蛋白聚集是 PD 发病的重要机制，因此 USP24 基因有可能参与 PD 的发生。LI 等2运用 SNP 进一步的病例 对照研究结果显示，USP24 基因与 PD 的发生有关
15、。以上两项研究均提供了 USP24 基因可能参与 PD 致病的遗传学依据，但由于病例 对照研究的结果并不精确，它提示真正的致病变异可能与这些 SNP 存在连锁不平衡，也可能是这些 SNP 本身参与 PD 的致病，因此，对于 USP24 基因是否真的参与 PD 的发生，还需要对该基因的蛋白编码区、5及 3UTR 区、甚至启动子和增强子、沉默子进行突变筛查分析，以明确 PD 病人中该基因在上述对基因功能起关键作用的区域是否存在变异。由于 USP24 基因的存在于 2005 年才得以证实，目前对它的启动子和增强子、沉默子所在区域还尚未确定，甚至近几年来它的外显子也是逐步被证实为目前的 68 个，因此
16、，在我们第一阶段的研究工作中，先完成了对该基因 exon3968 共 30 个外显子的突变筛查。 尽管 LI 等2的研究仅选择了迟发的散发 PD 病人进行了病例 对照分析，但 OLIVEIRA 等1在 2005 年的研究中，既纳入早发病人，也纳入迟发病人，因此在我们的研究中既包括了早发的 PD 病人，也包括了迟发的 PD 病人。 本研究在对 PD 病人的 USP24 基因 exon3968 的突变筛查中，并未发现外显子的任何变异，仅在外显子 内含子交界区检测到 11 种变异，可见该基因的 exon3968 蛋白编码区非常保守，也可能提示这段序列对维持 USP24 基因的功能非常重要。尽管我们的
17、样本相对较小，但也在一定程度上提示 USP24 基因的 30 个外显子(exon3968)的基因突变可能在中国人群中对 PD 的发病不起主要作用。未来，我们还需要对 USP24 基因的 exon138 进行突变筛查，以进一步了解该基因 5端的 38 个外显子有无氨基酸改变。目前我们所获得的 exon3968 突变筛查阴性结果的数据也可能是以下原因所造成。首先，我们的样本量相对较小，还不能很好地代表中国汉族 PD 病人的情况，在下一阶段的研究中还应该纳入更多的 PD 病人;其次，不论是 LI 等2还是 OLIVEIRA 等1的研究样本均来自高加索白人，而我们的样本为中国湖南汉族人，不能除外种族异
18、质性对 USP24 基因的影响，因此有必要在其他人种中对 USP24 基因进行突变筛查;最后，尽管我们在 95 例正常人中并未发现 c.7078+22 ag 变异，但 95 例正常人的样本量仍相对较小，有必要扩大正常人样本量再次对该SNP 进行病例 对照研究。同样，在外显子 内含子交界区检测到的其他10 种变异，也有必要进行病例 对照分析，对于那些在病人与正常人中分布频率不同的变异还需要进行下一步的功能研究，例如进一步明确那些位于剪切位点附近的变异是否有可能影响毗邻外显子的剪切。 综上所述，USP24 基因的 exon3968 基因突变可能在中国湖南地区PD 病人的发病机制中不起主要作用。 【
19、参考文献】 1OLIVEIRA S A, LI Y J, NOUREDDINE M A, et al. Identification of risk and ageatonset genes on chromosome 1p in Parkinson diseaseJ. Am J Hum Genet, 2005,77(2):252264. 2LI Y, SCHRODI S, ROWLAND C, et al. Genetic evidence for ubiquitinspecific proteases USP24 and USP40 as candidate genes for lateo
20、nset Parkinson diseaseJ. Hum Mutat, 2006,27(10):10171023. 3HUGHES A J, DANIEL S E, KILFORD L, et al. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinsons disease: a clinicopathological study of 100 casesJ. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 1992,55(3):181184. 4POLYMEROPOULOS M H, LAVEDAN C, LEROY E,
21、et al. Mutation in the alphasynuclein gene identified in families with Parkinsons diseaseJ. Science, 1997,276(5321):20452047. 5刘珂,滕继军,王修海. 散发性帕金森病 Parkin 基因突变检测J. 青岛大学医学院学报, 2009,45(2):104106. 6PAISANRUIZ C, JAIN S, EVANS E W, et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8linked Pa
22、rkinsons diseaseJ. Neuron, 2004,44(4):595600. 7VALENTE E M, ABOUSLEIMAN P M, CAPUTO V, et al. Hereditary earlyonset Parkinsons disease caused by mutations in PINK1J. Science, 2004,304(5674):11581160. 8RAMIREZ A, HEIMBACH A, GRUNDEMANN J, et al. Hereditary parkinsonism with dementia is caused by mutations in ATP13A2, encoding a lysosomal type 5 Ptype ATPaseJ. Nat Genet, 2006,38(10):11841191. 9HICKS A A, PETURSSON H, JONSSON T, et al. A susceptibility gene for lateonset idiopathic Parkinsons diseaseJ. Ann Neurol, 2002,52(5):549555.
