1、葡萄内酯和马尔敏的合成及活性研究作者：张普照 黎艳刚 涂明珠 张亚梅 陈海芳 杨武亮【摘要】 目的研究葡萄内酯和马尔敏的合成方法及生物活性。方法以香叶醇和伞形酮为起始原料，通过氯代、成醚反应合成葡萄内酯，再经 Sharpless 不对称烯烃羟基化反应合成马尔敏，采用 1H-NMR 对化合物进行结构鉴定;通过体外药理实验测定葡萄内酯对小鼠胃肠蠕动和大鼠脑组织匀浆中乙酰胆碱酯酶的影响。结果葡萄内酯和马尔敏的合成产率分别为 50.67%，20.5%;葡萄内酯促进胃肠动力作用强度为 44%，低、中、高 3 个剂量组均能明显抑制大鼠大脑组织匀浆乙酰胆碱酯酶的活性。结论该合成路线简单、产率高，能实现工业化
2、生产;葡萄内酯在促进胃肠动力和治疗老年痴呆新药研究具有潜在价值。 【关键词】 葡萄内酯; 马尔敏; 合成; 胃肠动力; 乙酰胆碱酯酶Abstract：Objective To study the synthesis and activity of auraptene and marmin.MethodsAuraptene was prepared by chlorinenation and etherification with geraniol and umbelliferone as starting material.Marmin was synthesized by sharpless
3、 aymmetric dhydroxylation with auraptene as material. The structures of products were identified by 1H-NMR spectra. The gastrointestinal propulsive motivity and acetylcholinesterase inhibition of auraptene were determined in vitro.ResultsTheir yield reached 50.67%, 20.5%,respectively.The bioactivity
4、 results indicated that auraptene showed similar gastrointestinal propulsive motivity with domperidone and the propulsive rate was higher than 44%.The low, middle and high doses of auraptene had the inhibitory effects on acetylcholinesterase in rat brain(P0.5).ConclusionThis synthetic route has adva
5、ntages of convenience,simple operation and high yield and is suitable for industrial manufacture.It has the potentiality in the study on medicine of the gastrointestinal propulsive motivity and Alzheimers disease.Key words：Auraptene; Marmin; Gastrointestinal Motility; Synthesis; Acetylcholinesterase
6、葡萄内酯和马尔敏是从葡萄皮和柑桔属植物中分离得到的，其生物活性近年来引起了研究人员的关注，文献报道马尔敏和葡萄内酯具有显著的抗肿瘤、神经保护、抗炎和自由基清除等活性16。我们通过动物模型实验研究发现葡萄内酯具有促进胃肠动力作用，两者很可能成为新药候选化合物，然而在植物中的含量均较低，影响对其的开发利用。我们对提取工艺进行优化后，虽能从枳壳等柑桔属植物中提取分离到千克级的葡萄内酯，然而提取费用较高;与葡萄内酯相比，马尔敏的植物来源更少，在植物中的含量更低。所以，开发葡萄内酯和马尔敏的化学合成方法既满足现实的迫切需要，又有着潜在的经济利益和学术价值。据文献与专利检索得知，目前尚无有关葡萄内酯化学合
7、成方法的报道，马尔敏的化学合成方法虽多有报道，但合成路线较复杂，收率较低，无法实现工业化生产7，8。本文结合手性合成的新研究成果，提出了全新的合成路线，合成路线如图 1 所示，以香叶醇和伞形酮为初始原料，通过氯代、成醚反应合成出葡萄内酯(3)，再经 Sharpless 不对称烯烃羟基化反应，合成马尔敏(4)，步骤少，目标化合物收率较高，适合工业化生产。图 1 葡萄内酯和马尔敏合成路线1 仪器与材料Bruker-Avance-400 核磁共振仪(TMS 为内标)，722 可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司制造)，DY89-1 型电动玻璃匀浆器(宁波新芝生物科技股份有限公司);氢溴酸加兰他敏注射
8、液(上海旭东海普药业有限公司)，乙酰胆碱酯酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所第一分所)，蛋白定量测定盒(南京建成生物工程研究所第一分所)，香叶醇(sigma 试剂)，三溴化磷(国药集团化学试剂有限公司)，7-羟基香豆素(AR，上海晶纯试剂有限公司)，AD-mix-(sigma 试剂)，其余试剂均为分析纯。动物：清洁级 KM 小鼠 80 只(雌雄各半，体质量 2022 g，江西省实验大小鼠生产基地提供);吗丁啉(西安杨森制药有限公司)。2 方法2.1 葡萄内酯和马尔敏的合成2.1.1 香叶基溴的合成9取香叶醇 5.0 g(0.032 mol)溶于 100 ml 无水石油醚中，加热溶解后，冰盐浴
9、下加入吡啶 2.6 ml，搅拌下缓慢滴加含有 PBr3 3.5 g(0.013 mol)的石油醚溶液 26 ml，冰盐浴下反应 3 h 后，向其中加入 10 ml 水和80 ml 甲醇的混合液，继续搅拌 5 min，分出有机层(上层)，用饱和NaHCO3 溶液洗至 pH=7，然后水洗，无水 Na2SO4 干燥，减压浓缩得无色油状液体 5.5 g，粗产率为 78%。2.1.2 葡萄内酯的合成10将上步反应产物 5 ml 加入到含 3.0 g7-羟基香豆素,33.4 gK2CO3,38.25 gKI 的 200 ml 丙酮溶液中，加热回流 7 h 后停止反应(TLC 监测)，冷却，过滤，滤饼丙酮洗
10、涤，合并母液，浓缩得黄色物质。将所得黄色物质甲醇溶解，拌样，过硅胶柱，用石油醚、醋酸乙酯梯度洗脱151(160 ml)、101(330 ml)，合并具有相同斑点的流份，减压浓缩得浅黄绿色针状结晶，甲醇重结晶后得针状无色结晶，即葡萄内酯 2.78 g，产率为 50.67%。2.1.3 马尔敏的合成11室温下将 3.477 3 g AD-mix- 加入到25 ml 正丁醇和 25 ml 水的混合溶液中，待完全溶解后冷却至 0，加入葡萄内酯 0.573 3 g,TLC 监测，反应 50 h 后,加入 3.8 g Na2S2O3,于室温反应 1 h，反应液用乙酸乙酯萃取 3 次，浓缩，甲醇溶解，拌样，
11、过胶柱，用石油醚醋酸乙酯(31，21，11)梯度洗脱，合并具有相同斑点的流份，浓缩得黄绿色物质，甲醇重结晶后得无色片状结晶，即马尔敏 0.13 g，产率为 20.5%。2.2 葡萄内酯的活性测试2.2.1 葡萄内酯对小鼠胃肠蠕动的影响小鼠 50 只，随机分为 5 组，每组 10 只，雌雄各半。对照组为蒸馏水组，吗丁啉组(6 mg/kg)，葡萄内酯低剂量组(0.6 mg/kg)，中剂量组(1.2 mg/kg)，高剂量组(2.4 mg/kg)。各组小鼠禁食不禁水 12 h，次日灌胃给药一次(0.4 ml/20 g)，过 60 min 后灌服阿拉伯胶活性炭粉混合物(0.3 mL/只)，20 min
12、后处死小鼠，立即取出胃肠，平铺，测定碳末前端至幽门的距离和小肠全长，以两者之比计算推进百分率。用于观察小鼠胃肠推进功能的指示剂为阿拉伯胶活性炭粉混合物 (2.5 g 纤维钠加水 62.5 ml，加入奶粉 4 g、糖 2 g、淀粉 2 g、活性炭 0.75 g，搅拌混匀，配成75 ml 的糊状物)。小肠推进率(%)=(碳糊移动距离/幽盲全长)100%2.2.2 葡萄内酯对大鼠脑组织匀浆 ACHE 的影响取雄性大鼠 3 只，断头取脑，用干净的滤纸吸干大脑组织表面的水分和血液。置于玻璃匀浆器中，按脑组织与生理盐水 19 的比例加入生理盐水，匀浆器匀浆 5 min，制成 10%匀浆，3 000 r/m
13、in 离心 10 min，取上清待测;每只大鼠的脑组织匀浆分为 5 组，加入等量不同浓度的葡萄内酯溶液及加兰他敏水溶液，空白组加入等量的双蒸水。葡萄内酯溶液浓度为(1，2，4 mg/L)，阳性药物加兰他敏水溶液(2 mg/L)，充分混匀后待测。采用双缩脲法测定蛋白总含量，用改良 Ellman 比色法测定 ACHE 的活力，平行实验 3 次。严格按照试剂盒上的说明进行操作，计算公式如下：蛋白标含量=测定管 OD 值-空白管 OD 值标准管 OD 值-空白管 OD 值标准蛋白浓度组织匀浆 ACHE 活力=测定管 OD 值-对照管 OD 值标准管 OD 值-空白管 OD 值标准管浓度/蛋白含量2.3
14、 统计学处理所测数据均以s 表示, 采用 SPSS11.5 统计软件进行两样本的 t 检验,P0.05 或 P0.01 认为有显著性差异。3 结果3.1 化合物波谱数据葡萄内酯：mp52.5(EtOAc)，1H-NMR(CDCl3)6.26(1H,d,J=9.6,H-3),7.65(1H,d,J=9.6,H-4), 7.36 (1H,d,J=8.4,H-5),6.87(1H,dd,J=2.4,8.4,H-6),6.82(1H,d,J=2.4,H-8),4.62(2H,d,J=6.4,H-1),5.54(1H, brt, H-2),2.42(1H,m, H-4),2.21(1H,m, H-4),
15、1.69(1H,m, H-5),1.52(1H,m,H-5),3.37(1H,dd,J=2,10.4,H-6), 1.78(3H,s,3-CH3),1.22(3H,s,7-CH3),1.17(3H,s,7-CH3 ),2.04(2H,6-OH,7-OH)，与文献一致12。马尔敏：mp117118(EtOAc),1H-NMR(PY-D6)6.30(1H, d, J=9.6,H-3)，7.65(1H,d,J=9.2, H-4),7.38(1H,d,J=8.4,H-5),6.94(1H,dd,J=8.4,2.4,H-6), 6.97(1H, J=2.4, H-8),4.64(2H,d,J=6.4,1
16、-CH2-),5.56(1H,brt,H-2), 2.13(4H,m,4, 5-CH2-),5.12(1H,brt,H-6),1.60(3H,s,8-CH3), 1.69(3H, s, 9 -CH3),1.52(3H, s,10-CH3)，与文献一致13。3.2 化合物活性3.2.1 葡萄内酯对小鼠胃肠蠕动的影响结果见表 1。与蒸馏水组相比，葡萄内酯低剂量时能明显的促进小鼠胃肠蠕动，具有显著性差异(P0.05)。表 1 葡萄内酯促进小鼠胃肠蠕动情况3.2.2 葡萄内酯对大鼠脑组织匀浆 ACHE 的影响结果见表 2。与蒸馏水组相比，低，中，高 3 个剂量组的葡萄内酯溶液均能明显的抑制大鼠大脑组织
17、匀浆 ACHE 的活性，具有显著性差异(P0.05 或 P0.01)。表 2 葡萄内酯对大鼠脑组织匀浆 ACHE 的抑制作用4 讨论文献中关于葡萄内酯的合成未见报道，马尔敏合成有报道，如R.M.Coates8等以香叶醇为原料经取代、醚化、加成、消除、再加成等5 步反应合成马尔敏，产率仅为 24%;Shun-ichi Yammada7等以 L-glutamic acid 为起始原料经过 10 步反应合成出马尔敏，产率相当低。近年来不对称合成技术的快速发展，发现了很多不对称合成试剂，因此我们采用不对称烯烃羟基化反应，经过 3 步反应合成出马尔敏，产率为20.5%，反应步骤少，条件温和，收率高，工艺
18、进一步研究优化后，产率将会再提高，能实现工业化生产。采用小鼠胃肠蠕动实验，发现葡萄内酯具有促进胃肠动力作用，推进率与吗丁啉相当，证明葡萄内酯在促进胃肠动力药物研究方面具有潜在价值;随着胃肠动力研究方法学的发展，发现促胃肠动力药有部分药物在发挥作用时可通过增加乙酰胆碱酯酶的释放或增强其兴奋作用,从而达到促进胃肠动力的作用，可见乙酰胆碱是促进胃肠运动的重要介质。抑制乙酰胆碱酯酶的活性是增加乙酰胆碱释放的重要途径，葡萄内酯在低浓度时可以明显促进小鼠胃肠蠕动，而葡萄内酯低、中、高 3 个剂量组的溶液均能明显的抑制大鼠大脑组织匀浆 ACHE 的活性，可见其作用机制可能与抑制乙酰胆碱酯酶的活性从而增加乙酰
19、胆碱的释放有关，所以在治疗老年痴呆新药研究也有很大研究价值。【参考文献】1 杨秀伟,徐 波,冉福香，等.40 种香豆素类化合物对人胃癌细胞株 BGC 和人肝癌细胞株 BEL-7402 细胞生长抑制活性的筛选J.中国现代中药，2006,8(11):7.2 Takuji Tanaka, Kunihiro Kawabata, Mikio Kakumoto,et al. Immunomodulatory action of citrus auraptene on macrophage functions and cytokine production of lymphocytes in female
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