1、哌嗪雌酚酮对生长期去卵巢小鼠胫骨骨形态计量学的影响【摘要】 目的 研究哌嗪雌酚酮(piperazinyl estrone，PE)对去卵巢小鼠胫骨松质骨和皮质骨骨量的影响，并探讨其作用机制。方法 70只昆明种 6周龄雌性小鼠，随机分为 7组: 基础对照组(Base 组)，假手术组(Sham 组)，去卵巢模型组(Ovx 组)，去卵巢+哌嗪雌酚酮低剂量组(PE1 组)，去卵巢+哌嗪雌酚酮中剂量组(PE2 组)，去卵巢+哌嗪雌酚酮高剂量组(PE3 组)，去卵巢+雌酚酮组(E 组)，连续灌胃给药 42d。实验后处死小鼠取左胫骨上、中段不脱钙骨制片，进行骨形态计量学参数测定。结果 哌嗪雌酚酮可使去卵巢小鼠
2、胫骨上段松质骨骨量增加、骨小梁分离度减少，骨形成和骨吸收降低。与 Ovx组比较，PE2组效果最佳，其松质骨骨量增加，骨小梁分离度减少，轻度抑制骨转换;哌嗪雌酚酮对胫骨中段皮质骨影响是促进内膜面骨形成，抑制内膜面骨吸收，但作用不显著。结论 哌嗪雌酚酮中剂量组(1.0 mgkg-1d-1)通过轻度降低骨转换，能有效防止去卵巢小鼠松质骨的骨丢失，对皮质骨作用不明显。 【关键词】 哌嗪雌酚酮;骨质疏松;去卵巢;骨形态计量学;小鼠骨质疏松己成为严重威胁老年人健康的重大问题，绝经后妇女骨质疏松的发病率为 50%，其病因主要是绝经后卵巢功能减退、雌激素水平降低引起骨质丢失。雌激素替代疗法(Estrogen
3、Replacement Therapy，ERT)为防治绝经后骨质疏松的有效方法之一1，但长期应用雌激素可能会增加患乳腺癌和子宫内膜癌的危险性2。哌嗪雌酚酮是四川大学华西药学院郑虎、翁玲玲两位教授合成的一种新型雌激素衍生物3，既往以去势大鼠和老年大鼠为研究对象观察该化合物对骨丢失的防治45 ，本实验以骨代谢快、成骨活性强、药物敏感性高的生长期去卵巢小鼠为动物模型，旨在探讨哌嗪雌酚酮在骨生长状态下对松质骨及皮质骨骨丢失的预防和作用机制，现将结果报道如下。1 资料和方法1.1 一般资料6 周龄雌性昆明种小鼠 70只(广东医学院动物中心提供)，体质量为(33.71.7)g，随机分成 7组，每组 10只
4、：基础对照组(Base 组)，直接将其处死取材;假手术组(Sham 组，注射质量浓度为 5gL-1羧甲基纤维素钠);去卵巢模型组(Ovx 组，给予质量浓度为 5gL-1羧甲基纤维素钠);去卵巢+哌嗪雌酚酮低剂量组(PE1 组，给予派嗪雌酚酮和羧甲基纤维素钠混合液 0.5mgkg-1d-1);去卵巢+哌嗪雌酚酮中剂量组(PE2 组，给予派嗪雌酚酮和羧甲基纤维素钠混合液 1.0 mgkg-1d-1);去卵巢+哌嗪雌酚酮高剂量组(PE3 组，给予派嗪雌酚酮和羧甲基纤维素钠混合液 2.0 mgkg-1d-1);去卵巢+雌酚酮组(E 组，给予雌酚酮和羧甲基纤维素钠混合液 0.71 mgkg-1d-1，其
5、中雌酚酮的浓度与 PE2 组中哌嗪雌酚酮的浓度相同)。除 Base组外，其他各组小鼠每周称重 1次，连续灌胃给药 6周。1.2 试剂哌嗪雌酚酮(纯品，由四川大学华西药学院骨质疏松课题组提供)，混悬于 5的羧甲基纤维素钠(上海化学试剂厂)。1.3 方法1.3.1 骨形态计量学检测6 所有小鼠于处死前第 2、3 天和第11、12 天分别皮下注射 7 mgkg-1钙黄绿素(Calcein)和 35mgkg-1盐酸四环素，42d 后，用质量浓度为 10gL-1的戊巴比妥钠麻醉并用注射器穿其右心室抽血处死，取左侧胫骨，并用低速锯(Buehler,LTD.USA)沿额状面锯开干骺端，以暴露骨髓腔，再于胫骨
6、上端 1/3处横行锯断胫骨，取近心端骨做不脱钙骨包埋后，用硬组织切片机(Leica2155,German)切成 8m 的厚骨片(用于测量松质骨动态参数)和 5 m 的薄骨片(采用MassonGoldner Trichrome染色后，进行酒精梯度脱水，过二甲苯，透明后树脂封片，用于测量松质骨的静态参数)。1.3.2 胫骨中段皮质骨骨片的制备6 用低速锯取胫骨中段 1/3，置于中性福尔马林固定 24h，经酒精梯度脱水，特殊骨染料 Villanueca Bone Stain染色 2d，再逐级脱水及丙酮脱脂后，用甲基丙烯酸甲酯包埋不脱钙骨，再用低速锯锯成 100m 的厚骨片，锯骨时从胫腓韧带联合近侧端
7、以胫骨干下端与腓骨完全分离为有效骨片。胫腓骨结合处为第 1片，接着往下依次为第 2片和第 3片，共锯 3片。用磨沙玻璃将第 2片磨成(2030)m 的薄片，再进行酒精梯度脱水，过二甲苯两次，透明后树脂封片。1.3.3 骨片测量 采用半自动数字化图像分析系统和测量软件(OsteoMeasure; OsteoMetrics, Inc,USA)用以测量骨形态计量学参数。胫骨上段松质骨静态参数包括骨小梁面积百分数(%Tb.Ar)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。胫骨上段松质骨动态参数包括：(1)反映松质骨的骨形成参数：荧光周长百分率(%L.Pm)、矿化沉积率(MAR)、骨形成率(B
8、FR/BS);(2)反映松质骨的骨吸收参数：每毫米破骨细胞数(N.Oc/Tb.Pm)。胫骨中段皮质骨静态参数包括皮质骨总面积(T.Ar)、皮质骨面积(Ct.Ar)和骨髓腔面积(Ma.Ar)。胫骨中段皮质骨动态参数包括皮质骨外膜面荧光标记周长百分数(%PL.Pm) 、皮质骨外膜面骨形成率(PBFR) 、皮质骨内膜荧光标记周长百分数(%EL.Pm) 、皮质骨内膜面骨形成率(EBFR) 和皮质骨内膜面骨吸收周长百分数(%Er.Pm)。1.3.4 统计学方法 计量数据以s 形式表示，SPSS13.0 统计软件分析，采用单因素方差分析、SNK 法进行组间比较，P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.
9、1 哌嗪雌酚酮对去卵巢小鼠体质量的影响Ovx、PE1 、PE2 、PE3 、E 组的体质量与 Sham组比较差异无统计学意义(P0.05)，而与 Base组比较差异有统计学意义;Sham 组与Base组比较差异无统计学意义，结果见表 1。表 1 哌嗪雌酚酮对去卵巢小鼠体质量的影响 与 Base组比较:*P0.05。2.2 哌嗪雌酚酮对生长期去卵巢小鼠松质骨骨计量学参数的影响Sham 组与 Base组比较骨小梁面积百分数有显著性增加，差异有统计学意义(P0.05);Ovx 组与 Sham组比较，骨小梁面积百分数降低、骨小梁数减少、骨小梁分离度增加，差异均有统计学意义(P0.05)。骨形成参数增加
10、但未表现出统计学意义，骨吸收参数显著增加(P0.05)，呈现高转化骨丢失的改变。PE1 、PE2 、PE3 组与Ovx组比较，骨小梁分离度和每毫米破骨细胞数均明显降低(P0.05);骨小梁面积百分数和骨小梁数均有不同程度的增加，但 PE1 组增加不显著，差异无统计学意义，而 PE2 、PE3 组与 Ovx组比较差异有统计学意义(P0.05)。E 组与 Ovx组比较，骨小梁面积百分数、骨小梁数均显著增加，而骨小梁分离度和每毫米破骨细胞数则明显降低(P0.05)，两组比较差异均有统计学意义。PE2 组与 E组比较(PE2 组中哌嗪雌酚酮的浓度与 E组中雌酚酮的浓度相同)，骨小梁面积百分数、骨小梁数
11、、荧光周长百分率和矿化沉积率均有一定程度的增加，而骨小梁分离度、骨形成率和每毫米破骨细胞数有所降低，两组比较，除每毫米破骨细胞数差异有统计学意义外(P0.05)，其他均无统计学意义，说明 PE2 组骨量的增加及对骨吸收的抑制作用都不及 E组，结果详见表 2。表 2 哌嗪雌酚酮对去卵巢小鼠胫骨上段松质骨的影响2.3 哌嗪雌酚酮对小鼠胫骨中段形态计量学的影响Sham 组与 Base组比较，皮质骨总面积、皮质骨面积无统计学意义;动态参数皮质骨外膜面荧光标记周长百分数和皮质骨外膜面骨形成率显著降低，差异有统计学意义(P0.05)。Ovx 组与 Sham组比较，皮质骨骨总面积和皮质骨面积无明显变化，骨髓
12、腔面积增加显著(P0.05);动态参数代表骨形成和骨吸收参数均所增加，但未表现出统计学意义(P0.05)。PE1 、PE2 、PE3 组与 Ovx组比较，静态参数无明显变化，动态参数内膜面荧光周长百分数和内膜面骨形成率略有增加，但差异均无统计学意义;而 PE3 组骨吸收周长百分数降低，与 Ovx组比较差异有统计学意义。E 组与 Ovx组比较，皮质骨面积增加，而骨髓腔面积减少，差异均有统计学差异(P0.05);动态参数皮质骨外膜面荧光周长百分数、内膜荧光周长百分数虽有增加，但差异无统计学意义;而骨吸收周长百分数则呈显著性降低(P0.05)，提示雌酚酮能通过促进骨形成和降低骨吸收防止去卵巢引起的皮
13、质骨的骨丢失。表 3 哌嗪雌酚酮对小鼠胫骨中段形态计量学的影响 (n=10)与 Base组比较:#P0.05;与Sham组比较:P0.05;与 Ovx组比较:P0.05。3 讨论国内外以小鼠为骨质疏松动物模型研究的报道较少，小鼠卵巢切除后的变化与大鼠相似，松质骨丢失明显7。同时小鼠的骨再建周期短，价廉易得，是快速研究抗骨质疏松药物的动物模型。本实验采用 6周龄雌性小鼠为实验对象，通过 Base组和 Sham组比较分析，松质骨骨形态计量学参数提示其骨代谢的特点：骨代谢活跃，生长旺盛，以骨的塑建为主，骨形成大于骨的吸收，处于正性平衡状态。手术切除卵巢造成人工绝经，Ovx 组与 Sham组比较，体质
14、量略有增加，但无统计学意义。松质骨计量学参数提示骨量明显减少，代表着骨形成和骨吸收的参数均增加，呈现出高转化型的骨丢失模型。PE 能够不同程度的提高去卵巢小鼠的松质骨骨量，对体质量无影响，其对松质骨的作用方式表现出对骨吸收有一定抑制，但对骨形成的抑制不明显，其中 PE2 组的荧光周长百分率及骨形成率维持在较高水平，同时反应成骨细胞活性的矿化沉积率也维持在较高水平。这可能与生长期小鼠活跃的骨增生状态有关，也可能是中剂量的哌嗪雌酚酮具有一定促进成骨的作用。阳性对照药物雌酚酮作用于去卵巢小鼠后(E 组)，骨量增加较 PE2 组明显，对骨的形成也未表现出明显的抑制作用，但抑制骨的吸收却比 PE2 组强
15、，这不符合骨骼生理的变化规律，其结果是骨更新减少，可能会导致骨的脆性增加8。皮质骨是哺乳动物长骨骨量的主要组成成份，占长骨骨量的 80%。在骨骼发育的进程中，骨皮质不仅决定着骨的形态和结构，而且对骨功能完善程度也起关键作用。皮质骨的改变可以使骨强度产生很大的变化9，因此对骨质疏松的研究不应忽视对皮质骨的观察。Base 组小鼠的皮质骨外膜骨形成率明显高于 Sham组(P0.05)，外膜面和内膜面的骨形成率及内膜面的骨吸收周长百分数均高于 Sham组，表现出生长期活跃的骨代谢特性。Ovx 组与 Sham组比较，皮质骨变薄，骨髓腔扩大，主要是由于去卵巢后雌激素水平降低，代偿性刺激成骨细胞和破骨细胞，
16、骨内膜面代表破骨细胞的骨吸收增加，而代表骨形成的荧光周长、骨矿化沉积率和骨形成也增加，出现骨高转化的改变，最终使骨髓腔面的骨吸收增加大于骨形成，骨髓腔扩大，这与 Ke等10报道的以去卵巢大鼠为模型的研究结果类似。PE 各组与 Ovx组比较骨计量学参数皮质骨面积增加，通过分析动态参数结果，哌嗪雌酚酮对去卵巢小鼠皮质骨的作用表现为对内膜骨吸收呈不同程度的抑制作用，其中 PE3 组作用显著(P0.05)，同时可促进内膜表面的骨形成，反映出一定的促成骨作用，但静态参数未表现出显著性变化，这可能是由于皮质骨对药物的反应不如松质骨明显。阳性对照药物雌酚酮则表现出明显的抑制内膜面的骨吸收，促进内、外膜面的骨
17、形成，雌酚酮能有效提高皮质骨骨量，降低骨髓腔面积，表现出对皮质骨丢失，防治作用较哌嗪雌酚酮强。但这种对骨吸收的显著抑制，可能不利于生长期骨构筑的调整和适应，最终可能会影响骨的生物力学特性11。综合本研究结果证实：哌嗪雌酚酮通过轻度的降低骨转换，能有效地防止去卵巢小鼠松质骨的骨丢失，以中剂量组(1.0mgkg-1)效果为佳，但其对皮质骨的作用不明显，同时其对骨丢失的防治效果要弱于雌酚酮。【参考文献】1 Studd J. Estrogens as firstchoice therapy for osteoporosis prevention and treatment in women under
18、 60J. Climacteric， 2009,12(3):210212.2 Subbiah M T. Estrogen replacement therapy and endometrial hyperplasiaJ. JAMA,1996， 275(24): 18801881.3 李灵芝，郑虎，翁玲玲.雌激素哌嗪类衍生物的合成及其促骨生长活性J.中国药物化学杂志，2000,10(1):3845.4 李青南，翁玲玲，黄连芳，等.哌嗪雌酚酮对去卵巢大鼠骨代谢的作用J.药学学报,2003,38(3):161164.5 武晓蓉，李青南，翁玲玲，等.新合成化合物哌嗪雌酚酮对老年大鼠骨代谢的作用J.生物
19、医学工程杂志，2005,22(1):5052.6 李青南.骨质疏松实验动物研究骨组织形态计量学M.成都：四川大学出版社，2001：2348.7 薛延，谭辉，王芊，等.2(3 羟丙氧) 骨化三醇(ED71)对卵巢切除小鼠骨生物力学与骨代谢的影响J.营养学报,2002,24(3):256259.8 Wronski T J, Yen C F, Scott K S. Estrogen and diphosphonate treatment provide longterm protection against osteopenia in ovariectomized ratsJ.J Bone Mine
20、r Res,1991,6(4):387394.9 Cater D R, Hayes W C. Bone compressive strength：the influence of density and strain rateJ.Science,1976,194(4270):11741176.10 Ke H Z, Jee W S, Zeng Q Q, et al. Prostaglandin E2 increased rat cortical bone mass when administered immediately following ovariectomyJ.Bone Miner,1993,21(3):189201.11 郭世绂.骨质量与骨质疏松症J.国外医学内分泌学分册，2005,25(5):295297.
