1、切割穹隆海马伞后大鼠海马中 83 ku 差异蛋白的质谱分析作者：朱蕙霞，秦建兵，金国华，田美玲，张新化，黄镇 【摘要】 目的： 探讨切割穹隆海马伞海马中具有诱导神经干细胞向神经元分化生物活性的 83 ku 差异蛋白的组成成分及其功能。 方法：切割 SD 大鼠穹隆海马伞后 14 d 海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)，应用电喷雾质谱分析、蛋白质数据库和文献分析等方法对 83 ku 差异蛋白进行检测和功能分析。 结果： 质谱分析找到了 17 组肽段，这些蛋白按照其功能可以分为：细胞骨架蛋白、参与代谢的酶、信号传递、蛋白降解、氧化应激、神经递质运输、突触形成、功能未知蛋白。结
2、论： 切割穹隆海马伞海马 83 ku 差异蛋白可以通过参与 Rho 信号通路，调控神经干细胞向神经元分化。 【关键词】 83 ku 蛋白； 切割穹隆海马伞； 海马； 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳； 质谱分析Abstract Objective: To explore the ingredients and functions of the active 83 ku proteins inducing NSCs to differentiate into neurons from the fimbria/fornix transected hippocampus.Methods： The Sprag
3、ueDawley rats hippocampi on the 14th day after fimbria/fornix transection were used for NativePAGE. Electrospray ionization mass spectrometry，protein data bank and bibliometrics were applied to identify the 83 ku proteins and analyze their functions. Results： Mass spectrometry analysis of 83 ku prot
4、ein found 17 groups of peptides which were divided into several functional groups：cytoskeletal protein，enzyme in metabolism，signal transduction，protein degradation，oxidative stress，neurotransmitter transport，synapse formation and unknown function protein etc. Conclusion： 83 ku proteins in the fimbri
5、a/fornix transected hippocampus may regulate the differentiation of NSCs into neurons via Rho pathway.Key words 83 ku protein； fimbria/fornix transection； hippocampus； Native PAGE； mass spectrometry analysis神经干细胞的发现为中枢神经损伤、退行性疾病以及脑肿瘤等的治疗提供了新思路，但其临床应用还要解决如何诱导神经干细胞迁移及分化等问题。我们近期的研究1，2观察到，移植至切割穹隆海马伞侧海马齿
6、状回中迁移的神经干细胞密度明显大于正常侧海马中迁移的密度，在切割侧移植的神经干细胞更易于向神经元分化；在体外细胞培养中，切割穹隆海马伞的海马提取液也比正常海马提取液更能促进神经干细胞向神经元和 AChE 阳性神经元分化3 。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)83 ku 蛋白胶条与神经干细胞共培养，证实该差异蛋白能够诱导神经干细胞向神经元分化，在此基础上4 ，本研究进一步应用质谱分析探讨 83 ku 差异蛋白的组成成分及其功能。1 材料和方法1.1 切割大鼠穹隆海马伞 取 220250 g 成年 SD 大鼠 10 只（南通大学实验动物中心提供） ，参照 Paxinos 图谱确定
7、双侧穹隆海马伞的切割范围，按文献2方法进行双侧穹隆海马伞切割，然后按性别分笼饲养。1.2 Native PAGE术后 14 d 取双侧海马组织制成匀浆，进行蛋白定量，然后将蛋白质浓度稀释调整为 3 gl 后分装，冻存于-70冰箱中备用。按文献5方法进行 NativePAGE 电泳，选取部分胶条进行考马斯亮蓝染色、脱色。1.3 电喷雾质谱分析（electrospray ionization mass spectrometry，ESIMS ）根据染色、脱色后凝胶显示的 83 ku 差异蛋白条带位置，切取切割穹隆海马伞后 14 d 海马组织蛋白胶条6 ，用胰蛋白酶水解 20 h 后，放入美国 Fin
8、nigan 公司生产的 LCQ DECA XP plus 质谱仪中进行 ESIMS分析，采用微量电喷雾的进样方式，毛细管温度为 170，柱面积为0.15 mm0.15 mm(RPC18) ，正离子检测。利用 Finnigan 公司系统中的 SEQUEST 检索程序，检索 IPI HUMAN 数据库（人类蛋白质组，HUPO 提供） 。检索条件设置为：当电荷为时，corr1.9；当电荷为2 时，corr2.2；当电荷为3 时，corr3.75；同时设定匹配肽段间 0.1，蛋 氨酸可变修饰16.00。1.4 蛋白功能分析 质谱分析检索后得到的蛋白质输入PubMed（www.ncbi.nlm.nih.
9、gov/entrez/query.fcgi?CMD=searchDB=PubMed）进行蛋白质功能文献分析。2 结果通过电喷雾质谱分析，在不同的时间点共鉴定到 70 组蛋白肽段（图1） ，经过数据库匹配，确定其中 17 种蛋白成分，搜索蛋白数据库和文献检索结果如表 1。表 1 切割穹隆海马伞后 14 d 海马组织 83 ku 蛋白名称与相关功能,Tab 1 Name and related function of 83 ku proteins in rats hippocampus on the 14th day after fimbriafornix transection（略）NDRG2b
10、2Nmyc 下游调节基因 1 的相关蛋白属于分化相关基因NDRG2 亚型，涉及神经元的分化，分布集中在生长锥上。受醛固酮诱导，可以激活 Ras 级联系统，可能在盐皮质激素的信号传导中有重要作用9 。6Profilin 2（Pfn2）原肌动蛋白抑制蛋白与肌动蛋白结合，影响细胞骨架的结构。在高浓度的时候，阻止肌动蛋白的聚合，而低浓度时加强肌动蛋白的聚合。还可以结合 PIP2，阻止 IP3 和 DG 的生成10 。PIIa 是脑内特异性的 Profilin，在神经分化的初期，RhoA/ROCK/PIIa 介导轴突的形成和延伸11 。 续表 1Tryptophan 5monooxgenase acti
11、vation protein，zeta，eta polypeptide 酪氨酸 3/5 单加氧酶活化蛋白 ， 属于 1433 蛋白家族成员，通过结合含有磷酸化丝氨酸的介导信号传递，调节细胞周期。11peroxiredoxin 2 （Prdx2）过氧化物酶 2 参与细胞内氧化还原反应，可以从硫氧还蛋白系统接受还原当量，可消除代谢中产生的过量 H2O2，在缺氧或脑损伤时通过调节 H2O2 参与 NGF 和 TNF 的信号传递反应13 。12Similar to coactosinlike 1 肌动蛋白共结合蛋白 1 以Ca2+非依赖性的方式与丝状肌动蛋白结合，与肌动蛋白解聚无关。13Ubiquit
12、in Carboxylterminal hydrolase isozyme L1（Uchl1）泛素 C 末端水解酶的同工酶 L1 主要表达在脑内神经元中，在海马和嗅球的再生神经元中含量少，在衰老的垂体后叶多，属于巯基蛋白酶，辨认、水解泛素 C 末端甘氨酸肽键或者结合游离泛素，阻止它在溶酶体中的降解14 。14Dimethylarginine DimethylaminohyDrolase 1（DDAH1 ）二甲基精氨酸的二甲基氨基水解酶参与 NO 的生成。15Rasrelated protein Rab3A （Rab3a）Ras 相关蛋白 Rab3A 是突触囊泡蛋白，作为神经递质在胞吐作用中参与
13、调解突触囊泡融合，在皮质杏仁核 LTP 和海马 CA1CA3 突触的 LTP 末期都是必需的15 。1645 ku protein45 ku蛋白功能未明。17Rho GDP dissociation inhibitor(GDI) alpha（Gdi1）Rho 蛋白的 GDP 解离抑制因子 抑制 Rho 蛋白smg p21s(ras p21like small GTPbinding proteins)蛋白的 GDP 解离、GTP 结合。而 smg p21s 与小脑的发育成正相关，表达在神经末梢16 。3 讨论本研究采用 ESIMS 检测切割穹隆海马伞后 14 d 的大鼠海马 83 ku差异蛋白胶
14、条中的多肽，通过质谱分析得到 17 种蛋白成分，这些蛋白按照其功能可以分为不同种类：细胞骨架蛋白、参与代谢的酶、信号传递、蛋白降解、氧化应激、神经递质运输、突触形成、功能未知。参与信号传导的蛋白种类最多，包括 GDI，Prdx2，NDRG1 相关蛋白，Pfn2，酪氨酸 3/5 单加氧酶活化蛋白，Rab3a，Gdi1 等，占蛋白肽段的 41%，如其中的 GDI，NDRG1 相关蛋白，Rab3a，Gdi1 可帮助机体启动损伤的激素应激反应、促进蛋白合成7 ；在中枢神经损伤后可促进突触的形成、突触内囊泡的运输等从而调节神经元分化；酪氨酸 3/5 单加氧酶活化蛋白、Prdx2 参与磷酸化的信号传导过程
15、，与调节损伤后细胞周期、细胞凋亡有密切关系；Pfn2 与轴突的生成和延伸相关，参与细胞骨架的生物合成。其次较多的为各种参与代谢反应的蛋白，如参与糖代谢（Glx I） 、氧化还原反应（Prdx2） 、神经递质合成（DDAH1 ） 、蛋白质代谢（Crym）等的酶。还有细胞骨架蛋白：Actin、微管蛋白 1 、肌动蛋白共结合蛋白 1，其中 Actin、肌动蛋白共结合蛋白 1 和 Pfn2（肌动蛋白结合蛋白）是通过相互作用从而改变肌动蛋白的稳定性，影响轴突的生成及分支。最少的为参与蛋白降解（Uchl1）的蛋白。本次检索中还有 1个蛋白（表 1 中的“16”号）没有查到相应的功能，将有待继续研究。神经元
16、的发育过程中，经历了从分化、迁移、极化、定向生长到与靶细胞建立突触联系的动态过程，也涉及损伤后的修复和再生过程。神经元突起末端的生长锥感受细胞外生长和导向信息，通过微管和微丝运动使细胞形成树突和轴突，并不断生长、延伸或坍塌。这些突触之间的联系在神经元自身和周围细胞活动的作用下得到优化，通过突触的巩固、突触的消除、新突触的形成，最终建立起成熟的神经回路。其中神经元轴突的生成是启动神经干细胞迁移和向神经元分化的第一步，体外海马神经元培养中剔除 Pfn2 基因实验中，发现 RhoA/ROCK/PIIa 调节肌动蛋白的稳定性，参与海马神经元分化11 。RhoA 属于 Rho 家族鸟苷三磷酸酶(Rho
17、GTPases)，是调节细胞骨架运动的主要信号，细胞外生长和导向因子(如 Slit)首先通过细胞膜上相应的受体(如 Robo)启动 Rho 激酶，进而通过坍塌反应调节蛋白影响细胞骨架的重排。Rho GTPase 能与 GTP/GDP 结合，以 GDP 结合和 GTP 结合两种状态存在，前者为非活化状态，后者为活化状态。Rho GTPase 循环的调节有 3 类分子：嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)、Rho 酶活化蛋白(GAPs)和解离抑制因子(Rho GDIs)17 。上游信号分子和受体通过激活上述 3 种分子调节 Rho GTPase。与 Rho GTPase 和 actin 细胞骨架联系的中
18、间蛋白主要有：NWASP ，Park，Rock 和 mDia。Rock 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，为 Rho 的作用分子，通过 RhoA/ROCK/PIIa 作用于 profilin，调节 actin聚合作用18，19 。在 83 ku 蛋白中除了 Pfn2，还可观察到 GDI，Actin，NDRG1 相关蛋白，Tubulin，Similar to coactosinlike 1，Rab3a，Gdi1,7 种蛋白都可参与上述 Rho 信号通路。由本实验结果可推测，切割穹隆海马伞后，这些蛋白通过相互的作用，可以启动神经干细胞向损伤部位迁移、向神经元分化，Rho 信号通路参与其中调节神经轴突再生。
19、如何有效地调控 Rho 信号通路,促进神经干细胞分化为神经元，减少细胞死亡，改善中枢神经系统损伤后功能的恢复，还有待进一步研究。【参考文献】1金国华，张新化，田美玲，等大鼠海马内移植神经干细胞的存活和迁移J 神经解剖学杂志，2003，19(4)：378-382.2张新化，金国华，秦建兵，等穹隆海马伞切割侧海马对植入神经干细胞分化为神经元的影响J 神经解剖学杂志，2004，20(4)：360-364.3金国华，张新化，田美玲，等穹隆海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元的促进作用J 解剖学报，2004，35(2)：137-141.4张蕾，金国华，田美玲，等切割海马伞大鼠海马中 65 kD
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