1、羟基喜树碱半固体脂质纳米粒制备工艺研究【摘要】 目的制备羟基喜树碱的半固体脂质纳米粒(HCPT-SSLN)。方法在单因素考察的基础上，通过正交设计优选处方和制备工艺，并对优化条件下制备的 HCPT-SSLN纳米溶液进行质量评价。结果制备的 HCPT-SSLN平均粒径为 130.5 nm，多分散系数为 0.18，载药量为 2.51，包封率为 79.19， 电位为-33.1mV；纳米溶液 4下放置 6个月，纳米粒外观、粒径及包封率无明显变化。结论所制备的 HCPT-SSLN包封率和载药量较高，粒径分布均匀，稳定性良好，为羟基喜树碱的临床应用提供了更广阔的前景。 【关键词】 羟基喜树碱； 半固体脂质
2、纳米粒； 制备工艺Abstract：ObjectiveTo prepare hydroxycamptothecin semisolid lipid nanoparticles (HCPT-SSLN). MethodsBased on the single-factor experiment, the HCPT-SSLN was prepared by orthogonal design for optimization of formulation and technology. Then the obtained SSLN was evaluated. ResultsThe mean par
3、ticle size of the prepared HCPT-SSLN was 130.5nm, Polydispersity index(PI) was 0.18, drug loading(DL) was 2.51, entrapment efficiency(EE) was 79.19, potential was -33.1mV; Placed at 4 for 6 months, the appearance, particle size and entrapment efficiency of SSLN were all stable.ConclusionThe HCPT-SSL
4、N has high entrapment efficiency and drug loading, uniform particle size, good stability, which provides an extensive prospect for clinical application of HCPT.Key words：Hydroxycamptothecin; Semisolid lipid nanoparticles(SSLN); Preparation纳米粒载药系统自 1976年由 Birrenbach首次报道以来，由于其具有可生物降解、低免疫性、有一定靶向性且制剂形式多
5、样化等优点，至今已取得很大发展1 。固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles, SLN)是粒径为 501000nm 的新一代亚微粒给药系统2 ，它能将药物包裹于类脂核中而使药物稳定性增加，并具有缓控释、靶向、低毒等优点。羟基喜树碱(hydroxycamptothecin, HCPT)是拓扑异构酶(TOPO-)抑制剂35 。它抗瘤谱广，且无交叉耐药性，目前已作为临床一线用药。但因其特殊的理化性质：水不溶脂难溶、内酯环结构不稳定等因素，使得目前临床应用受到了限制6 。本研究在单因素考察的基础上，通过正交设计优选处方和制备工艺，以固体脂质和液体脂质混合物为载体材料制备 HC
6、PT的半固体脂质纳米粒(semisolid lipid nanoparticles, SSLN)，并对优化条件下制备的 HCPT-SSLN纳米溶液进行了质量评价。1 仪器与试剂UNICAM UV500紫外分光光度计(英国 Thermo Spectronic公司)；激光粒度仪-3000HS(英国 Malvern Instruments Ltd)；冷冻干燥机(LABCONCO FreeZone 12L)；JEM-2010 透射电子显微镜(TEM)(日本株式电子会社)；TMP-1 型电子天平（德国 Sartorius公司） 。10-羟基喜树碱原料药(含量 98，四川广汉市生化制品有限公司)；Palm
7、itic acid(十六酸，汕头市西陇化工厂)；Dynasan 118(三硬脂酸甘油酯，Sasol)；Corn oil(玉米油，Sigma)；注射用大豆卵磷脂(上海太伟药业有限公司)；Solutol HS 15(聚乙二醇 15羟基硬脂酸醋，BASF)；Cremophor EL(氢化蓖麻油，BASF)；PEG-8-辛酸癸酸甘油酯(GATTEFOSSE)；辛酸/癸酸三甘油酯(浙江兰溪物美化工有限公司)；泊洛沙姆 188(Sigma)；卖泽 Myrj 59、苄泽 Brij 53(Sigma)，其它试剂均为分析纯；双蒸水用前经 0.45m 微孔滤膜过滤。2 方法2.1 HCPT-SSLN的制备采用乳化
8、蒸发-冷却固化法制备 HCPT-SSLN。称取一定量的 HCPT、脂质、卵磷脂共溶于适量有机溶剂中制得有机相，另称取适量表面活性剂溶于水中制得水相，在 75水浴下，将有机相匀速注入水相中，避光恒温搅拌，挥干有机溶剂并浓缩至一定体积，将此半透明乳液快速分散于适量 0冰水中继续搅拌固化 0.5 h，经 0.8 m 微孔滤膜过滤，即得 HCPT-SSLN。以纳米粒的外观、粒径、包封率为考察指标，分别考察了有机溶剂种类、有机相种类、表面活性剂种类、固态脂质/液态脂质摩尔比、药脂比、有机溶剂用量、表面活性剂浓度、水相与油相中表面活性剂比例、乳化过程中水相与油相比例、有机相注入水相速度、乳化蒸发搅拌时间、
9、搅拌速度等单因素的影响。2.2 正交设计优化 HCPT-SSLN的制备工艺在单因素实验考察的基础上，选择药脂比(A)、固态脂质与液态脂质的摩尔比(B)、表面活性剂浓度(C)3 个因素，每个因素选择 3个水平，按正交设计表 L9（34）实验。以包封率为指标，按正交结果拟定的最佳处方和工艺制备 3批样品，对制得的 HCPT-SSLN进行质量评价来对优化结果进行验证。2.3 HCPT-SSLN冻干粉的制备按 2 ml/瓶将 HCPT-SSLN分装在 7 ml的西林瓶中，每瓶中加入 4.0%的乳糖，搅拌使完全溶解，放入冷冻干燥机，按照 0.5/min 降温至-34并维持 24 h，在冷凝器低温、干燥箱
10、保持一定真空度条件下，按照 0.07，0.04，0.07/min 三阶段升温至25，保温 10 h，取出样品，压盖处理，即得 HCPT-SSLN冻干粉剂。2.4 HCPT-SSLN 纳米溶液的质量评价2.4.1 形态、粒径分布和 电位测定取 HCPT-SSLN适量，稀释，滴加在覆盖碳膜的铜网上，室温(25)下以 2.0%的磷钨酸钠液负染，透射电镜下观察粒径大小和形态。取 HCPT-SSLN适量，稀释，波长 633 nm处 Malvern激光粒度仪上测定其粒径和 电位。2.4.2 HCPT 的含量测定精密称定 1.0 mg HCPT置 50 ml量瓶中，用 pH 12.0 NaOH溶液(0.01
11、 mol/L)配制浓度为 20 gml-1 的溶液作为贮备液。紫外扫描结果表明其最大吸收波长为 414 nm，且所有辅料在该波长处的紫外吸收对测定结果无干扰。另取贮备液分别配制浓度为0.2，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 gml-1 的溶液，以其在 414 nm处的吸收光度 A为纵坐标，浓度 C为横坐标，得标准曲线方程：A0.067 8C+0.001 3(r0.999 9)，表明 HCPT在 0.210.0 gml-1浓度范围内线性关系良好。样品处理方法：取 1.0 ml HCPT-SSLN用 pH 5.0 PBS液稀释定容至25.0 ml，取其中 1.0 ml于试管中，加入
12、一定量的氯仿和 pH 12.0 NaOH溶液，涡旋混匀离心，取上清液于 414 nm处测定吸收光度。另取 pH 5.0 PBS液 1.0 ml，同法操作得空白对照品。回收率测定：取 HCPT贮备液配制浓度为 0.4，4.0，8.0 gml-1的溶液，各取 1.0 ml，用 pH 12.0 NaOH溶液稀释到 5.0 ml。另取 1.0 ml空白纳米粒混悬液，用 pH 5.0 PBS液稀释定容至 25.0 ml。取 1.0 ml分别加入上述 3种浓度的溶液中，按“2.4.2”项下方法处理后测定，各浓度组重复 3次。2.4.3 包封率(EE)测定包封率(EE)指被包封于纳米粒中的药物含量与投药总量
13、的比值。精密吸取 1.0 ml HCPT-SSLN混悬液上样于Sephadex G-50柱，以 pH5.0PBS液洗脱，洗脱速度为 1 mlmin-1，收集乳白色流分，取 1.0 ml按“2.4.2”项下方法处理，测定包封在脂质体内的 HCPT浓度 C1；另取 1.0mlHCPT-SSLN混悬液，加 pH5.0PBS液稀释到 25.0 ml，同法测定脂质体制剂中的 HCPT浓度 C2，EE=C1/C2100%。2.4.4 载药量(DL)测定载药量(Drug Loading Coefficient，DL)系指纳米粒中所含药物量占制剂总量的百分率。即 DL=投药量EE /HCPT-SSLN冻干粉总
14、量100。2.4.5 稳定性考察取适量 HCPT-SSLN纳米溶液分别置于室温(25)、4条件下放置 6个月，考察其稳定性。观察项目为外观、形态、粒径及包封率。2.5 统计学处理数据采用 SPSS12.0软件处理，s 表示，P0.05时有显著性差异。3 结果3.1 单因素考察在文献调查及单因素考察的基础上可知：HCPT 是主药；十六酸、三硬脂酸甘油酯、玉米油是基本脂质膜材；大豆卵磷脂一有乳化作用，能增加脂质膜的稳定性，防止药物渗漏；二有抗氧化作用，防止 HCPT和脂质氧化；还有脱模、降低粘度及分散作用等；Solutol HS 15主要作为稳定剂和分散剂；丙酮和乙醇有利于溶解各种脂质材料，并维持
15、 HCPT内酯形式；因而最后筛选出来的基本处方组成为：HCPT、十六酸、三硬脂酸甘油酯、玉米油、大豆卵磷脂、Solutol HS 15、丙酮和乙醇。另由考察确定以下参数：表面活性剂为 Solutol HS 15：Soya lecithin为 11，有机相溶剂采用 12 ml丙酮：6 ml乙醇，水相与油相比为 1.5/1，有机相注入水相选定 2.0 ml/min的滴速，搅拌速度为 800 r/min，乳化蒸发搅拌时间为 2h。此外，固态脂质与液态脂质的摩尔比对包封率影响明显，2/1 时包封率最高，将其范围定为 1/24/1；药脂比对包封率和粒径影响明显，1/8 时制备工艺不稳定，将其范围定为1/
16、401/15；表面活性剂过少则不能制备，过量易引起粒子聚合，故将其浓度范围定为 1.5%5；这 3个因素仍需进一步考察优化。3.2 正交设计实验因素和水平见表 1，正交设计表及结果见表2，方差分析结果见表 3。表 1 因素水平（略）表 2 正交设计 HCPT-SSLN的结果（略）表 3 F检验的结果（略）由表 2可见，各个因素不同水平对 SSLN包封率的影响由大到小依次为：A1A3A2，B2B3B1，C3C2C1；R 为极差值，RCRBRA，即表面活性剂浓度对 SSLN的包封率影响最大，其次是固态脂质与液态脂质的摩尔比，再次是药脂比；当表面活性剂浓度为 5时，包封率均在70以上；而当表面活性剂
17、浓度只有 3时，包封率几乎都不超过55；为了保证药效，包封率是关键性指标，故我们选取 A1B2C3为最佳处方条件，即药脂比为 120，固态脂质与液态脂质的摩尔比为 21，表面活性剂浓度为 5，例如，以投药量 10mg计算，需十六酸、三硬脂酸甘油酯、玉米油各 66.7mg，大豆卵磷脂和 Solutol HS 15各 450 mg。由表 3可见只有 C因素的 F值大于0.05(2,2)，说明只有表面活性剂浓度对包封率的影响有统计学意义，为主要影响因素，其次为固态脂质与液态脂质的摩尔比，再次是药脂比。经验证，3 批样品平均包封率为 81.43。3.3 HCPT-SSLN 纳米溶液的质量评价3.3.1
18、 形态、粒径分布测定所制备的 HCPT-SSLN混悬液为均一、稳定的半透明状分散系，体系略带淡蓝色乳光。激光散射法测定 3批样品的平均粒径为（130.514.41）nm，多分散系数为 0.18，说明粒径分布均匀；透射电镜观察结果表明，纳米粒为圆整的球状体，无明显团聚现象。对电镜所拍摄的粒径数据(N=502)采用 SAS软件进行正态统计分析，结果粒径呈非正态分布，结果见图 1。图 1 HCPT-SSLN的 TEM图（原放大倍数：5 000） （略）3.3.2 电位测定 电位与纳米粒体系的稳定性密切相关。测定 电位可以预测纳米粒的储藏稳定性。3 批纳米粒 电位平均为（-33.13.30 ）mV，见
19、表 4。表 4 HCPT-SSLN的粒径、 电位、包封率和载药量的测定结果（略）3.3.3 包封率、载药量和回收率预实验表明 PBS液(pH5.0)能完全洗脱脂质体，但对游离 HCPT无洗脱能力，故该测定方法可靠。测得包封率为（79.192.78），RSD 为 3.51，载药量为（2.510.17），RSD 为 6.69（见表 4） 。平均回收率为（100.311.14），RSD 为1.14。3.3.4 pH 3批样品用 pH计测定，pH 值分别为6.26，6.29，6.31，平均（6.290.023） ，RSD 为 0.366。3.3.5 冻干粉的水分散性及粒径分析冻干粉样品呈现白色疏松块状
20、，注射用水及生理盐水中分散性良好。另取少许粉末，同“2.4.1”项下操作，Malvern 测得平均粒径为（138.915.28）nm。3.3.6 稳定性考察 HCPT-SSLN纳米溶液于室温(25)避光放置6个月后，出现了霉菌、絮状或胶状沉淀，黄色药物结晶析出等现象。4条件下避光放置 6个月后，无沉淀及药物结晶析出，为均一、稳定的半透明状分散系，且测得平均粒径为（141.87.84）nm，包封率为（77.291.63），表明在 4条件下该制剂的稳定性要比常温下好。4 讨论HCPT 的溶解性较差，在正辛醇中的表观溶解度是其在蒸馏水中的 27.2倍，HCPT 还能插入磷脂酰基链中，有一定亲和力7
21、。其常见临床用量为 515mg/d，故以大量脂质来包封少量 HCPT是可行的。固体脂质纳米粒的制备方法很多，因为 HCPT不溶于水，与磷脂有一定的亲和力，当HCPT溶于有机溶媒后与水溶液接触时，HCPT 即大量析出。鉴于此性质，采用乳化蒸发法较好，推测制备原理是使 HCPT在高速搅拌过程中进入熔化的脂质液滴，插入磷脂双分子层中而被脂质核包封，内外水相中的游离药物有部分吸附在脂质核表面，这样制备的纳米粒有较高的包封率，但具体脂质与 HCPT的作用关系还需进一步研究。HCPT 在液体脂质中的溶解度比在固体脂质中大，引入液体脂质可增大其包封率，因此在固体脂质载体中引入 Corn oil制备 SSLN
22、，液态脂质的加入还能延缓固态脂质由 晶型向 晶型的转化和减少药物的渗漏8 。本实验选择已正式收入欧洲药典的 Solutol HS 15作为水相中的表面活性剂，因为和其他非离子表面活性剂相比，它除了具有更好的增溶稳定性，更低的机体代谢毒性，还在体外抗表皮样癌实验中表现出明显的抗多药耐药性，被认为是一种潜在的抗肿瘤治疗因素9 ，目前被广泛应用于静注、口服等多种剂型的辅料。单因素考察结果也说明它能有效增进 HCPT的溶解性，增加 SSLN包封率和稳定性。通过考察诸多对 HCPT-SSLN粒径和包封率有影响的单因素，本实验筛选出药脂比、固态脂质与液态脂质的摩尔比、表面活性剂浓度为制备的 3个关键要素，并通过正交设计获得了优化工艺和处方，但方差分析结果说明只有表面活性剂浓度对包封率的影响有统计学意义，故还存在对包封率、粒径影响较大的其它因素，有待进一步研究。通过质量评价，本实验所制备的 HCPT-SSLN包封率和载药量较高，粒径分布均匀，稳定性良好，为羟基喜树碱的临床应用提供了更广阔的前景。【参考文献】1 杨绮华. 药物载体系统的研究进展J. 中国新药杂志, 2002, 11(8): 593.2 王建新, 张志荣. 固体脂质纳米粒的研究进展J. 中国药
