1、氢化可的松对体外培养的皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的影响作者：卫俊霞,冯光珍,孙红,于大山,汪培铭,李冬梅 【关键词】 细胞增殖 【Abstract】 AIM: To study the effects of hydrocortisone on the proliferation and collagen synthesis of skin fibroblasts in vitro and to explore the mechanism of steroid in the treatment of abnormal scars. METHODS: Human scar fibroblasts
2、 were isolated and cultured from human skin by mechanical separation methods. After being stimulated by hydrocortisone with different concentration, the proliferation and collagen synthesis of human skin fibroblasts were determined by MTT methods and 3HProline incorporation respectively. RESULTS: Hy
3、drocortisone （0.1 g/L） inhibited the proliferation (MTT 0.5230.051 vs 0.3470.036, P0.05) and collagen synthesis 3HProline (2486) Bq vs (1816) Bq, P0.05 of human skin fibroblasts in vitro in a concentration dependence manner (r=-0.8208). CONCLUSION: Hydrocortisone may treat abnormal scars by inhibiti
4、ng the proliferation and collagen synthesis of human skin fibroblasts. 【Keywords】 hydrocortisone; skin fibroblasts; proliferation; collagen; scars 【摘要】 目的：研究激素对体外培养的成纤维细胞增殖及分泌功能的影响，初步探讨其治疗瘢痕的作用机制. 方法：采用 MTT 比色法和3H 脯氨酸掺入法，观察氢化可的松对体外培养的皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的影响. 结果：氢化可的松（0.1 g/L）能够抑制体外培养成纤维细胞增殖（MTT 值 0.5230.0
5、51 vs 0.3470.036, P0.05）及分泌胶原的功能3H 脯氨酸掺入量(2486) Bq vs (1816) Bq, P0.05 ，并呈剂量依赖性（r=-0.8208）. 结论：氢化可的松可通过抑制瘢痕成纤维细胞增殖及胶原的合成，从而达到治疗瘢痕的作用. 【关键词】 氢化可的松；皮肤成纤维细胞；细胞增殖；胶原；瘢痕 0 引言 激素在增生性瘢痕的治疗中已广泛应用，并取得了较好的治疗效果，但其作用机制尚未完全阐明1. 我们通过人皮肤成纤维细胞的体外培养，观察氢化可的松对细胞增殖及其胶原合成的影响，进一步探讨激素在增生性瘢痕治疗中的作用机制. 1 材料和方法 1.1 材料 DMEM 高糖
6、培养基及小牛血清（HyClone） ，胰蛋白酶（Gibco） ，四甲基偶氮唑盐（MTT）及离解蛋白 Dispase(Sigma)，氢化可的松（华美公司） ，二甲基亚砜（DMSO，TBD 公司） ，3H 脯氨酸（北京原子能研究所）. 皮肤组织取自手术患者所取的全厚或中厚瘢痕皮肤，刮除皮下脂肪组织，尽快放入盛有 DMEM 培养液中备用. 1.2 方法 将取下的标本切取 5 mm5 mm 大小的小块置于含青霉素和链霉素各100 ku/L 的 DMEM 溶液中，2 h 后将组织标本浸于 2.5 g/L dispase 中，37条件下 24 h 后，表皮被完整的撕下，余下的真皮组织用 PBS 反复冲洗后
7、，剪成 12 cm 的小块，加入 3050 倍体积的 1 g/L型胶原酶，37条件下继续消化 35 h. 当成纤维细胞大部分从胶原纤维中分离出来时，用 100 目滤网过滤，以去除大的组织残渣. 滤液离心去上清液，细胞记数后接种于 75 cm2 培养瓶中，置 37含 50 mL/L CO2 孵箱中培养，每 34 d 换液 1 次，待细胞融合后，进行细胞传代培养. 取第二代人皮肤成纤维细胞，以 1104/孔接种于 96 孔板，无血清培养孵育 2448 h，使细胞同步于休止期. 弃上清液，加入培养基和氢化可的松，分别进行成纤维细胞形态、数量及生物合成的检测. 氢化可的松浓度分别为0.05，0.1，0
8、.2，0.3 和 0.5 g/L，设空白对照组. 倒置显微镜观察各组成纤维细胞形态与数量变化，同时，细胞用 20 g/L 戊二醛固定后进行扫描电镜观察. MTT 比色法测定成纤维细胞增殖2:氢化可的松加入 20 h 后加入 MTT 20 L/孔，置 37含 50 mL/L CO2 孵箱中孵育 4 h，再每孔滴加 DMSO 溶解缓冲液 20 L，在微型混合器上振荡 1520 min，置37孵育 4 h，倒置显微镜下观察到针状染料结晶溶解，酶标仪波长 570 nm 处读取 A 值. 3H 脯氨酸掺入法测定成纤维细胞胶原的合成3:氢化可的松加入 12 h 后弃上清 100 L，加入 3H 脯氨酸、V
9、itC 及 氨基丙混合液（终浓度皆为 10 mg/L）100 L，继续培养 12h 后吸弃上清，加入 2.5 g/L 胰蛋白酶 200 L 消化细胞，多头细胞收集器收集细胞，液闪测定仪测定细胞 3H 脯氨酸掺入量（Bq）. 统计学处理: 所有结果均以 xs 表示，应用 SPLM 统计软件行 t 检验和卡方检验. 2 结果 2.1 氢化可的松对皮肤成纤维细胞增殖的影响对照组细胞生长良好，多贴壁生长，呈梭形或星形，排列成束状或旋涡状（Fig 1A）. 氢化可的松处理组对皮肤成纤维细胞的增殖有抑制作用，当其浓度为 0.1 g/L时，细胞增殖受到抑制，表现为细胞收缩变圆，数量明显减少，交织成网状（Fi
10、g 1B） ，当其浓度升至 0.5 g/L 时，细胞不能存活（Fig 1C）. 扫描电镜观察显示，对照组细胞呈梭形或椭圆形，微绒毛较多，可见足突和分裂相（Fig 2A） ；而氢化可的松处理组细胞呈圆形，微绒毛明显减少，表面光滑，无足突，较少见分裂相（Fig 2B）. MTT 比色分析显示，氢化可的松对皮肤成纤维细胞的增殖有明显的抑制作用（P0.05） ，且其抑制作用呈明显的剂量依赖性（Tab 1）. 2.2 氢化可的松对皮肤成纤维细胞胶原合成的影响 3H 脯氨酸掺入法测定成纤维细胞胶原的合成情况显示，氢化可的松可以抑制皮肤成纤维细胞 3H 脯氨酸的掺入，且其掺入量与氢化可的松的浓度呈负相关，相
11、关系数 r=-0.8208，P0.05（Tab 1）.表 1 氢化可的松对体外培养皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的影响（略） 3 讨论 皮肤异常瘢痕一般是皮肤创面持续过度修复的结果，这种持续过度修复的主要原因是：成纤维细胞的过度增殖、活化及迁移；成纤维细胞的生物合成增加，引起细胞外基质尤其是大量胶原的合成及沉积4,5. 临床实践表明，应用类固醇药物可以限制瘢痕的范围. 一般认为其效应途径主要是核结合模式：类固醇药物通过与细胞膜融合后进入靶细胞内，然后与细胞核受体结合形成二聚体，继而与 DNA 激素反应区域特异性地紧密结合，激活 DNA 转录，从而影响靶细胞功能6 ；同时，类固醇药物可与免疫系统多
12、种基因的主要转录因子相结合，干扰 mRNA 的稳定性，抑制免疫活性物质的释放7. 本研究应用氢化可的松作用于体外培养的皮肤成纤维细胞，结果显示：氢化可的松对皮肤成纤维细胞的增殖有明显的抑制作用，同时，氢化可的松可以抑制皮肤成纤维细胞胶原的合成，且其抑制作用呈明显的剂量依赖性. 因此，可以推测：类固醇药物对皮肤瘢痕的影响，可能是抑制成纤维细胞增殖及胶原合成并促进细胞凋亡而实现的. 【参考文献】 1 Nuutinen P, Riekki R, Parikka M, et al. Modulation of collagen synthesis and mRNA by continuous and
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