1、青藤碱对类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞增殖及基质金属蛋白酶-3 表达的影响作者：张娟 李娟 赵毅 余克强【摘要】 ：目的 观察青藤碱对体外培养类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞增殖以及基质金属蛋白酶-3(MMP-3)mRNA 含量的影响。方法 培养人成纤维样滑膜细胞,分为青藤碱高、中、低剂量组和空白对照组,经青藤碱干预后,用四甲基偶氮唑蓝法测定细胞增殖情况,用半定量 RT-PCR方法检测成纤维细胞中 MMP-3 mRNA 的表达。结果 经青藤碱干预后的人成纤维样滑膜细胞的增殖率受到显著抑制(P0.05),其中高剂量组的改变差异尤为显著(P0.01)。MMP-3 的 mRNA 表达水平较之空白对
2、照组有显著下降(P0.05),且高剂量组的差异尤为显著(P0.01)。结论 青藤碱可以抑制类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞的增殖并下调 MMP-3的表达,推断这可能是青藤碱治疗类风湿关节炎的一种机理。 【关键词】 类风湿关节炎 青藤碱 成纤维样滑膜细胞 基质金属蛋白酶-3Abstract：Objective To observe the effect of sinomenine on the proliferation of fibroblast-like synoviocytes (FLS) and expression level of MMP-3 secreted by FLS in r
3、heumatoid arthritis in vitro. Methods FLS were obtained by digesting synovial tissues with collagens and were divided into four groups：sinomenine high, middle, low concentration and control group. The proliferation of FLS was assessed by methyl- thiazolyl-tetrazolium (MTT) assay and the mRNA express
4、ion of MMP-3 was measured by semi-quantitative RT-PCR respectively after treated by sinomenine. Results The rate of FLS proliferation was significantly reduced in groups treated by sinomenine. Compared with control group, the mRNA expression of MMP-3 markly decreased in sinomenine groups (P0.05) and
5、 especially in sinomenine high group (P0.01). Conclusion Sinomenine can effectively inhibit the proliferation of FLS and reduce the mRNA expression of MMP-3 of FLS in rheumatoid arthritis, that may be a mechanism in therapy of rheumatoid arthritis by sinomenine.key words：rheumatoid arthritis；sinomen
6、ine；fibroblast-like synoviocytes；MMP-3类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种常见的以关节组织慢性炎症为主要表现的自身免疫性疾病。病变关节主要表现为炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成以及由此引发的软骨、骨和关节囊的损伤,最终可以导致关节的畸形和功能丧失。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)是一种可以在 RA 的发病中引起关节损害的主要效应细胞。FLS 分泌的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是一族锌离子依赖性的内源性蛋白水解酶,可以直
7、接降解软骨和骨质从而对关节造成破坏。由于许多外来信息都必须首先激活 MMP-3 后才能活化其它 MMPs,所以,FLS 分泌的 MMP-3 在关节破坏过程中所起的作用非常重要1。研究表明,青藤碱(sinomenine,SIN)治疗 RA 具有较明确的疗效,具有抗炎、免疫抑制、镇痛等药理作用,且毒副作用较小,临床上得到了广泛的应用2。但是,SIN 对于 RA 患者 FLS 分泌的 MMP-3 作用尚不清楚。本实验就 SIN 对 RA 患者 FLS 的增殖以及其MMP-3 的 mRNA 表达进行研究。1 材料与方法1.1 标本取材RA 滑膜均取材于南方医院脊柱骨科因 RA 行全膝关节置换术或关节镜
8、滑膜切除术患者的关节滑膜组织,所有患者均符合 1987 年美国风湿病学会修订的 RA 分类标准3,患者对取材均知情同意。1.2 主要材料和仪器超净工作台、普通离心机、CO2 培养箱、荧光倒置显微镜、酶联仪(BIO-RAD Model 550)、PCR 仪(Perkin Elmer 公司)。SIN 干粉(含量98%,性状为白色粉末)由湖南正清公司提供；高糖 DMEM 培养基、胰蛋白酶均购自 GIBICO 公司；胎牛血清(FBS)、胶原蛋白酶、EDTA、四甲基偶氮唑蓝(MTT)均购自 Sigma 公司；Trizol 试剂、引物(上海生物工程技术服务有限公司)；RT-PCR 试剂盒宝生物工程(大连)
9、有限公司。1.3 人成纤维样滑膜细胞的分离培养手术中获得的滑膜组织,在无菌条件下用 D-Hanks 液洗涤 34 次,剔除脂肪组织后获得白色滑膜组织,修剪收集的滑膜组织的滑膜层,充分剪碎,加入胶原酶消化,用含 10% FBS 的 DMEM,直接分散贴附于培养瓶底部,置CO2 培养箱(5% CO2、37 )培养。34 d 更换培养基,去除未贴壁的组织块,以后 23 d 更换 1 次培养基。利用光学显微镜对人 FLS 进行鉴定,待长满培养瓶底后,用 0.25% 胰酶-0.02% EDTA 混合消化液消化,传代分瓶培养,以第 25 代 FLS 进行实验。1.4 人成纤维样滑膜细胞的药物干预及分组将
10、SIN 溶于 DMEM 基础培养基中,按照参考文献4方法设立高、中、低剂量组,配制成浓度分别为 0.3、0.1、0.05 mmol/L 的 SIN 溶液。在传代后培养的第 3 天分别按照高、中、低浓度加入 SIN 溶液,对照组加入等量 DMEM 培养液,于培养第 8 天收获。采用光镜观察鉴定滑膜细胞。1.5 MTT 法检测细胞增殖取处于对数生长期的 FLS,用含有 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA 的消化液反复吹打,制成细胞悬液,用锥虫蓝拒染法检测细胞活力95%。将细胞悬液 1 000 r/min、离心 5 min 后弃上清,各组细胞用含有血清的 DMEM培养基分别稀释至 5106/L
11、。细胞悬液接种于 24 孔板,每孔加入 800 L,12 h 后换液,用按照 0.3、0.1、0.05 mmol/L 配制好的含有高、中、低不同浓度 SIN 的 DMEM 培养液对各组细胞进行培养,空白对照组加入等量的 DMEM 培养基,37 、5% CO2 进行培养。按照文献5方法,在第 8 天用 MTT 比色法测定各组的 A 值均值,记录并计算不同浓度组和空白对照组对 FLS 的抑制率抑制率(%)1试验组 A 值/对照组 A 值均值100%。1.6 细胞总 RNA 提取采用 Trizol 一步法提取人滑膜细胞的总 RNA,经紫外分光光度计测量260 nm 和 280 nm 吸光度,二者比值
12、在 1.71.9 之间。1.7 逆转录聚合酶链式反应取 2 g 总 RNA,42 30 min,99 5 min；进行 30 个周期的 PCR逆转录后,进行 PCR 扩增,以 -肌动蛋白(- actin)作为内对照。采用DNAman 软件设计引物,引物序列及扩增产物长度见表 1。表 1 MMP-3 与-actin 引物序列（略）按照宝生物工程(大连)有限公司 RT-PCR 试剂盒(AMV)说明进行 PCR扩增。扩增参数设置如下：94 2 min 预变性 1 个循环,每个周期为 94 变性 30 s,55 退火 30 s,72 延伸 2 min。取 PCR 产物置于 2% 琼脂糖凝胶中电泳,溴化
13、乙锭染色,电泳条带经 Hema 凝胶图像分析系统作条带密度扫描,结果以 MMP-3 与 -actin 密度比值作为 MMP-3 表达参数,对MMP-3 PCR 产物相对定量。1.8 统计学方法采用 SPSS10.0 统计软件进行数据分析,结果以 xs 表示,各组数据经过正态检验和方差齐性检验后,进行单因素方差分析,P0.05 为差异有显著性意义。2 结果2.1 人成纤维样滑膜细胞的培养鉴定胶原酶消化法培养的人 FLS 在培养 1 周后在倒置显微镜下可见组织块周围呈放射状生长,10 d 见细胞开始脱离组织块呈梭形生长且连成网状,2周左右细胞成片生长,3 周细胞长满瓶底,且细胞排列整齐,呈现明显的
14、方向性；传代后的细胞在 12 h 内完全贴壁,初期呈网状分布生长,以后随细胞数量的增长逐渐紊乱无明显的方向性,细胞形态以梭形为主,交织成网,网间散布有较多多边形细胞。在光镜下可观察到：细胞呈卵圆形、梭形或柱形,有短突起, 核呈卵圆形位于细胞中央,有时可见多核巨噬细胞样细胞,生长良好,纯度高,细胞形态无改变。2.2 青藤碱对人成纤维样滑膜细胞体外增殖的影响实验结果显示,较之于空白对照组,不同浓度试验组的细胞增殖均受到明显抑制(P0.05),其中高浓度剂量组的细胞增殖受到的抑制最为明显(P0.01)。见表 2。表 2 各组对 FLS 增殖抑制率的影响(略) 注：与空白对照组比较,*P0.05,*P
15、0.01；与 SIN 低剂量组比较,P0.05(下同)2.3 RT-PCR 检测的结果MMP-3 的 mRNA 经逆转录聚合酶链式反应扩增后的扩增产物大小与预期一致。Hema 凝胶图像分析系统作条带密度扫描显示,MMP-3 与 -actin产物的 OD 比值,SIN 高剂量组与空白对照组之间存在显著差异(P0.01),低剂量组与空白对照组之间差异有显著性(P0.05),表明 SIN 对人滑膜细胞 MMP-3 的表达具有抑制作用。其检测结果见图 1、表 3。表 3 RA患者 FLS 中 MMP-3 mRNA 的表达(略)3 讨论RA 以持续存在的滑膜炎为特点,其慢性滑膜增生主要表现为滑膜衬里层细
16、胞增生、炎性细胞浸润以及滑膜下层血管生成,进而导致关节组织包括肌腱、关节囊、软骨和骨进行性和不可逆性破坏以及功能障碍。FLS 是关节滑膜细胞中的一种主要细胞,可以根据环境的变化发生演变,存在异常的增殖与分泌。研究证实,在体外分离和培养的情况下,滑膜各层的 FLS 和血管翳细胞几乎没有区别3。FLS 不但参与滑膜组织对关节软骨及关节周围骨组织的破坏,而且还分泌多种细胞因子,如肿瘤坏死因子、白细胞介素-1 等,相互作用,构成细胞因子网络,持续刺激滑膜细胞,使得关节软骨过度增殖,刺激炎症反应,间接导致关节软骨的破坏1。这些都提示 FLS 是一种可以引起关节损害的主要效应细胞。RA 的关节组织破坏主要
17、是结缔组织的细胞间质降解以及溶解的结果。而结缔组织细胞间质以及软骨的降解和溶解长期以来被认为与细胞因子刺激下软骨和滑膜细胞产生的 MMPs 有关6。MMPs 是一组在结构上具有极大同源性、能降解细胞外基质蛋白的内肽酶的总称。MMPs 对 RA 的关节破坏作用可以概括为两个途径,一是直接降解软骨和骨质,二是在血管生成方面具有重要作用,这是 RA 的显著特征7。在 RA 的早期,增生的滑膜组织在向关节软骨面生长的同时侵蚀关节软骨,形成血管翳,血管翳中含有大量的成纤维细胞,可以释放胶原蛋白酶、MMP-3 等8；同时,FLS 在一些细胞因子的刺激下也可以分泌 MMP-3,进而激活胶原蛋白酶,通过滑液作
18、用于无血管翳附着的软骨进而引起骨组织的破坏。这种分泌的 MMP-3 也是一种对基质起广泛作用的蛋白酶,被认为是导致软骨降解的最重要的蛋白酶,它对 RA关节的破坏作用主要在于软骨和骨质8。有研究证实,滑膜细胞、成纤维细胞、软骨细胞都可以分泌 MMP-3,其活化可以导致软骨连接蛋白、纤维连接素以及多种胶原酶等蛋白酶的降解,被认为是降解关节软骨最为关键的蛋白酶7。所以,MMP-3 在 RA 中的研究近年来也得到了越来越多学者的重视。研究发现,RA 患者血清中的 MMP-3 水平显著高于正常对照组,而且其水平的升高与 RA 的活动性有关9。同时还发现,RA 患者关节滑液中MMP-3 含量明显增高而且其
19、滑膜中的 MMP-3 蛋白和基因均处于过度表达状态10。所以,抑制 FLS 增殖已成为治疗 RA 的重要手段之一。在对 RA 患者关节滑膜液中的糖蛋白降解产物进行进一步的分析中发现,其核心蛋白成分都是在对 MMP-3 易感的位点处被裂解11。这些也都提示,MMP-3 在RA 关节的破坏中起着极为重要的作用。我们研究发现,RA 患者滑膜组织是大量增生的,SIN 可以显著抑制 FLS的增殖,同时,SIN 还可以显著抑制 MMP-3 的 mRNA 表达,且实验初步表明,高剂量组较之低、中剂量组的抑制效果更加明显(P0.01)。提示 SIN可以通过抑制 RA 患者 FLS 的增殖以及降低其 MMP-3
20、 的 mRNA 表达而抑制关节滑膜组织的降解,减轻 RA 患者关节的破坏作用。【参考文献】1 Takayanagi H, Iizuka H, Juli T, et al. Involvement of receptor activator of nuclear factor KappaB ligand/osteoclast differentiation factor in osteoclastogenesis from synoviocytes in rheumatoid arthritisJ. Arthritis Rheum,2000,43(2)：259269.2 汪倪萍,魏 伟.中药活性
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