1、醛固酮对肾小球系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物 1 基因表达的影响作者：李晓东, 丁新国, 张红梅, 高山林, 李英【摘要】 目的: 探讨醛固酮（ALD）对大鼠肾小球系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物 1(PAI1) 基因表达的影响。方法: (1)以不同浓度的ALD(10-11、 10-10、 10-9、 10-8、 10-7 mol/L)刺激肾小球系膜细胞72 h 后, 用半定量 RTPCR 法检测该细胞中 PAI1 mRNA 的表达。(2)以 10-7 mol/L 的 ALD 刺激肾小球系膜细胞不同时间（12、 24、 48、 72 h）后, 用半定量 RTPCR 法检测该细胞中 PAI1 mRNA
2、 的表达。结果: 半定量 RTPCR 结果显示, ALD 促进培养的大鼠肾小球系膜细胞PAI1 mRNA 的表达, 且具有浓度依赖性和时间依赖性的特点。结论: ALD 促进大鼠肾小球系膜细胞 PAI1 mRNA 的表达, 从而抑制细胞外基质的降解, 促进肾小球疾病进展。 【关键词】 醛固酮 肾小球系膜细胞 纤溶酶原激活物抑制物 1醛固酮(ALD)在慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)发病过程中的作用越来越受到重视, ALD 通过血流动力学改变和直接作用于肾脏造成肾脏损害1。体外研究表明, ALD 通过促进培养的肾小球系膜细胞合成分泌细胞外基质(extracell
3、ular matrix, ECM)和转化生长因子1（TGF1 ）的表达导致肾小球硬化2。纤溶酶原激活物抑制物1(PAI1) 是 ECM 积聚的重要的调节因子, PAI1 的表达增加能使 ECM 降解减少, 从而导致肾小球硬化3。本实验中研究 ALD 对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞 PAI1 基因表达的影响, 以进一步探讨 ALD 在 CKD 发病机制中的作用, 并为临床应用醛固酮受体拮抗剂治疗 CKD 提供实验依据。1 材料和方法1.1 材料 DALD 购自 Sigma 公司; RPMI1640 培养基购自 Gibco公司; TRIzol 总 RNA 提取试剂及逆转录（RT）试剂盒购自 Inv
4、itrogen 公司; 80120 g 雄性 SD 大鼠购自北京大学医学部实验动物中心。1.2 方法1.2.1 大鼠肾小球系膜细胞培养与鉴定 取 80120 g 雄性 SD大鼠 4 只进行原代培养并传代, 培养方法和细胞鉴定参见有关文献4。取第 68 代细胞用于实验。1.2.2 半定量 RTPCR 法检测肾小球系膜细胞 PAI1 mRNA 的表达 肾小球系膜细胞培养于 100 mL 培养瓶中, 处于对数生长期时换成含5 mL/L 的 FCS 的 RPMI1640 培养液 24 h 使细胞处于静止期（G0 期） 。实验分组如下: （1）观察浓度效应: 实验组加入含有不同浓度（10-11、 10-
5、10、 10-9、 10-8、 10-7 mol/L）ALD 的培养液 , 对照组加入等体积（6 mL）的含 100 mL/L FCS 的 RPMI1640 培养液, 继续培养 72 h 后收集细胞。(2)观察时间效应: 实验组加入含有 10-7 mol/L ALD 的培养液, 对照组加入等体积（6 mL）的含 100 mL/L FCS 的 RPMI1640 培养液, 继续培养 12、 24、 48、 72 h 后收集细胞。实验重复 3 次。细胞总 RNA提取按 TRIzol 总 RNA 提取试剂说明书操作。cDNA 第 1 链的合成: 应用Invitogen 公司提供的 SuperScrip
6、tTM FirstStrand Synthesis System for RTPCR 试剂盒进行, 反应总体积为 20 L。引物如下: PAI1(382 bp): 上游 5TCG GCA CAA TCC AAC AGA3; 下游 5TGC TGA GTG AAG GCG TAG3 。GAPDH (452 bp) 上游 5ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC3; 下游 5TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA3 。由上海生工公司合成。PCR 反应条件为: 先于 94变性 3 min, 然后于 94 1 min, 54 1 min, 72 1 min, 共 30 个循
7、环后, 再于72延伸 7 min。分别取 6 L PCR 产物进行 20 g/L 琼脂糖凝胶电泳, 凝胶在 UVP 凝胶成像系统中扫描观察结果并拍照, 分析电泳带灰度, 计算目的基因与内参 GAPDH 基因扩增带灰度之比值, 即得目的基因 mRNA 的表达量。1.2.3 统计学分析 实验数据用 xs 表示, 使用 SAS8.1 统计软件进行统计描述, 多个样本均数的比较采用单因素方差分析（OneWay ANOVA）, 多个样本均数间每 2 个均数的比较选择 SNK 法(q 检验)分析。2 结果2.1 大鼠肾小球系膜细胞的鉴定 倒置显微镜下观察传代培养的细胞呈梭形或星形, 胞核圆形或卵圆形, 胞
8、质向外伸出较多长短不一的突起。免疫细胞化学鉴定抗结蛋白染色阳性, 抗细胞角蛋白、 抗因子相关抗原染色阴性。表明所培养的细胞为大鼠肾小球系膜细胞（图 1） 。2.2 ALD 呈浓度依赖性地促进肾小球系膜细胞 PAI1 mRNA 的表达 以不同浓度的 ALD (10-11、 10-10、 10-9、 10-8、 10-7 mol/L)刺激肾小球系膜细胞 72 h 后, 半定量 RTPCR 结果显示, 随着 ALD 浓度的升高, PAI1 mRNA 的表达量（以 PAI1/GAPDH mRNA 表示）明显增加, 在 10-7 mol/L 时达高峰, 与对照组比较, 差异有统计学意义（P0.01） 。
9、表明 ALD 促进肾小球系膜细胞 PAI1 mRNA 的表达, 且具有一定的剂量依赖性（图 2） 。图 1 大鼠肾小球系膜细胞的鉴定（略）A: 倒置显微镜下传代培养的肾小球系膜细胞（ 100）; B: 免疫细胞化学抗结蛋白抗体染色阳性（400）; C: 免疫细胞化学细胞抗角蛋白（CK18 ）抗体染色阴性（400）; D: 免疫细胞化学抗因子相关抗原染色阴性（400）.图 2 不同剂量的 ALD 对肾小球系膜细胞 PAI1 mRNA 表达的影响（略）M: DNA marker; 1: 对照组; 2: 10-11 mol/L ALD 组; 3: 10-10 mol/L ALD 组; 4: 10-9
10、 mol/L ALD 组; 5: 10-8 mol/L ALD 组; 6: 10-7 mol/L ALD 组.2.3 ALD 呈时间依赖性地促进肾小球系膜细胞 PAI1 mRNA 的表达 以 10-7 mol/L 的 ALD 刺激肾小球系膜细胞不同时间（12、 24、 48、 72 h）后 , 随着作用时间的延长, PAI1 mRNA 的表达量明显增加, 在 72 h 时达高峰, 与对照组比较, 差异有统计学意义（P0.01） 。表明 ALD 促进系膜细胞 PAI1 mRNA 的表达, 且具有一定的时间依赖性（图 3） 。图 3 ALD 作用不同时间对肾小球系膜细胞 PAI1 mRNA 表达的
11、影响（略）M: DNA marker; 1: 对照组; 2: 12 h; 3: 24 h; 4: 48 h; 5: 72 h.3 讨论研究表明, 在慢性肾小球疾病中, ECM 积聚是导致肾小球硬化的重要因素, ECM 的产生增加和(或)降解减少是 ECM 积聚的主要原因5。目前认为纤溶酶原/纤溶酶系统在 ECM 的降解中起主导作用。PAI1 是纤溶酶原激活物的主要生物抑制剂, 在调节该系统活性中起关键作用。因此, PAI1 的变化在肾小球硬化的发生和发展中起着重要作用6。晚近研究表明, ALD 是造成肾脏损害的重要物质1。应用醛固酮受体拮抗剂螺内酯减少了糖尿病大鼠肾脏 TGF1 和 PAI1
12、的表达, 减轻了糖尿病大鼠的早期肾损害, 阻止了肾小球硬化的发生7。我们曾经报道, ALD 促进肾小球系膜细胞合成分泌 ECM 和 TGF1, 导致肾小球硬化2。ALD是否直接影响肾小球系膜细胞 PAI1 基因表达, 从而导致 ECM 降解障碍和 ECM 积聚, 目前尚未见报道。本研究结果表明, ALD 呈剂量和时间依赖性地促进大鼠肾小球系膜细胞 PAI1 mRNA 的表达。肾小球系膜细胞 PAI1 mRNA 表达增加将抑制纤溶酶原活化物 tPA 和 uPA 的生物学功能, 使纤溶酶原转变为纤溶酶减少, 导致肾小球内 ECM 降解障碍6。同时, ALD 刺激肾小球系膜细胞合成分泌 ECM 和
13、TGF1 2, 其最终效应是过多的 ECM 在肾小球系膜区积聚, 促进 CKD 的进展。综上所述, 我们认为, 慢性肾衰竭时高 ALD 血症是毁损残余肾功能的因素之一, ALD 通过促进 PAI1 产生的机制促进肾小球病变进展, 导致残余肾功能进一步下降。应用醛固酮受体拮抗剂有可能延缓肾小球疾病的进展。【参考文献】1 Ibrahim HN, Hostetter TH. Aldosterone in renal diseaseJ. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2003, 12(2): 159-164.2 李晓东, 陈孝文, 唐德燊, 等. 醛固酮对肾小球系膜细胞合成
14、分泌纤维连接蛋白和 TGF1 表达的影响J. 细胞与分子免疫学杂志, 2007, 23(2): 140-142.3 Krag S, Danielsen CC, Carmeliet P, et al. Plasminogen activator inhibitor1 gene deficiency attenuates TGFbeta1induced kidney diseaseJ. Kidney Int, 2005, 68(6): 2651-2666.4 Harper PA, Robinson JM, Hoover RL, et al. Improved methods for culturi
15、ng rat glomerular cellsJ. Kidney Int, 1984, 26(6): 875-880.5 Schnaper HW, Kopp JB. Renal fibrosisJ. Front Biosci, 2003, 8(1): 68-86.6 Baricos WH, Reed JC, Cortez SJ. Extracellular matrix degradation by cultured mesangial cells: mediators and modulatorsJ. Exp Biol Med, 2003, 228(9): 1018-1022.7 Fujisawa G, Okada K, Muto S, at al. Spironolactone prevents early renal injury in streptozotocininduced diabetic ratsJ. Kidney Int, 2004, 66(4): 1493-1502.
