1、去甲氯胺酮半抗原及其全抗原的合成与鉴定作者：杨婷婷 赵春城 沈笑平 谈伯昌 邹盘坤 王怀明 刘凌云 韦超 魏万里 何金海 吴杰 张东升 赵晓联【摘要】 在低温条件下，去甲氯胺酮与琥珀醛酸反应，合成了半抗原羧基-去甲氯胺酮，电喷雾质谱鉴定结果表明，目标半抗原合成成功；通过碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原，红外光谱法鉴定结果表明，人工抗原合成成功，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定表明去甲氯胺酮半抗原与牛血清白蛋白的偶联比为 111。经动物免疫，获得高效价特异性多克隆抗体，抗血清效价可达 5.12104。 【关键词】 去甲氯胺酮； 半抗原； 人工抗原； 合成； 鉴定Synthesis
2、 and Identification of Hapten and Complete Antigen of Norketa mineY Ting-ing， Z Chun-heng，S iao-ing，T o-hang，Z an-un，W uai- ing,L ing-un，W hao， an-Li，HE Jin-Hai，WU Jie，ZHANG Dong-Sheng，Z iao-ian（Jiangsu SUWEI Microbiology Research Co.，LTD.， Wuxi 214063)(Wuxi Municipal Public Security Bureau，Wuxi 214
3、002)(Zhenjiang Municipal public Security Bureau，Zhenjiang 212001)(Jiangyin Municipal public Security Bureau，Jiangyin 214405)Yancheng Municipal public Security Bureau，Yancheng 224001) Abstract Under low temperature conditions，the hapten carboxyl-norketamine was synthesized by reacting norketamine and
4、 succinaldehyde acid.Identification result using electrospray ionization mass showed the hapten was successfully synthesized.The artificial antigen confirmed by infrared spectroscopy was developed by conjugating hapten to carrier proteins with carbodiimide(EDC) method.Matrix-assisted laser desorptio
5、n ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS) showed that the ratio of hapten to BSA was 111.The antibody with high titer(5.12104) was produced after immuning to rabbits.Keywords Norketamine；Hapten；Artificial antigen；Identification1 引言氯胺酮（Ketamine，KET）是一种通过静脉给药的短效麻醉剂，其进入血循环后大部分进入脑组织，然后
6、再分布于全身组织中，肝、肺和脂肪内的药物浓度也较高。由于 KET 是毒品“K 粉”的主要成分，近年来，其非法滥用现象严重。由于 KET 代谢的半衰期较短，摄入体内后，代谢生成去甲基氯胺酮(Norketa mine，NKET)、去氢去甲基氯胺酮(Dehydronorketamine，DHNK)，因此在生物检材（如血液、尿液、毛发等）中代谢物的含量比较高1,2，作为检测指标，KET 代谢物(主要是NKET)的检测比 KET 的检测更加重要，而且对嫌疑人是否吸食 KET 的确认更加有效。目前，检测 KET 及其代谢物的分析方法主要有：气相色谱法（GC） 、气-质联用法（GC-MS） 、高效液相色谱法
7、（HPLC） 、液-质联用法（LC-MS） 、高效毛细管电泳法（HPCE）酶联免疫吸附法（ELISA）等311。由于常规仪器分析不适于批量样品的筛选检测，关于 NKET 的免疫分析技术国内迄今尚未见相关报道。本文设计合成了 NKET 的半抗原，并与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联得到人工抗原，经免疫新西兰大白兔后，获得高效价的特异性多克隆抗体，为建立 NKET 的免疫学检测方法提供了强有力的技术支持。2 实验部分2.1 仪器与试剂Spectronic 1.70 紫外可见光分光光度计（意大利 GBC 公司） ；Nexus 670 型傅立叶变换红外光谱仪（ Nicolet 公司） ；
8、Voyager DE STR基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（美国应用生物系统公司） ； MK3 酶标仪（雷勃公司） 。去甲氯胺酮标准品（英国 Tocris 公司） ；牛血清白蛋白（BSA，Sigma 公司） 、卵清蛋白（OVA，Sigma 公司） ；弗氏完全、不完全佐剂（北京生物制品研究所） ；四甲基联苯胺（TMB） 、羊抗兔 IgG（北京博奥森有限公司） ；其他试剂均为分析纯。2.2 实验方法2.2.1 半抗原合成 取 10 mg NKET、3 mg 氰基硼氢化钠（NaBH3CN）或 40 L 15%琥珀醛酸溶液，分别加入 6，1 和 1 mL 混合溶剂(四氢呋喃-吡啶为 51， ）至完全
9、溶解，于 4 冰箱放置备用；将琥珀醛酸溶液逐滴加入到 NKET 溶液中，4 下磁力搅拌，反应 5 min；再逐滴加入 NaBH3CN 溶液，将反应混合物在 4 下磁力搅拌 23 h，直至反应完全后，将反应物低温（40 ）旋转蒸发至干，所得产物即为 NKET 半抗原（羧基-NKET） 。2.2.2 人工抗原的合成 取上述 NKET 半抗原 13.8 mg，溶于 1 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，滴加 50 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC，溶于 0.5 mL H2O） ，搅拌反应 20 min 后，将该反应液滴加至 20 mg BSA（溶于 10 mL H2
10、O 中）立即加入 52 mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS） ，室温下搅拌过夜。PBS 透析 48 h，冷冻干燥。包被抗原（NKET-OVA）的合成方法同上。合成路线见图解 1。图解 1 去甲氯胺酮人工抗原合成路线（略）Scheme 1 Reaction scheme of synthesis for norketamine(NKET) antigen2.2.3 半抗原和人工抗原的结构鉴定 所得的 NKET 半抗原和免疫抗原（NKET-BSA）的分子结构鉴定分别采用质谱法（MS-ESI）和红外光谱法（IR）确证。2.2.4 抗体制备及效价测定 以偶联物 NKET-BSA 为免疫抗
11、原免疫雄性新西兰大白兔，1 mg/kg 体重。基础免疫采用背部皮下多点注射，加强免疫采用四肢内部肌肉注射，间接酶联免疫吸附法（iELISA）测定效价合格后，颈动脉放血，分离抗血清，采用饱和硫酸铵沉淀法7纯化抗体，制成冻干粉，于20保存。采用 ELISA 法测定纯化抗体的效价。3 结果与讨论3.1 半抗原分子结构的鉴定经 LC-MS 法（如图 1）分析得出，LC 图谱中 8.71 min 对应的峰是过剩的反应物，而 9.45 min 对应的峰经 MS 法分析结果可知，分子离子峰 m/z 312（310+2H+） ，分子离子峰 m/z 308（3102H） ，因此，质谱分析结果初步说明反应产物为目
12、标化合物，即 NKET 半抗原。图 NKET 半抗原的 HPLC-MS 图谱（略）Fig. HPLC-MS spectrum of NKET hapten3.2 人工抗原 NKET-BSA 结构鉴定采用固体 KBr 压片，对 NKET-BSA 冻干粉、BSA 和 NKET 进行 IR 测定。如图所示。通过比较 BSA 和 NKET-BSA 的红外吸收光谱发现，在28003400 cm1 区域以及 15001700 cm1 区域具有相似的吸收，此为蛋白质中氨基酸的特征吸收，说明合成的 NKET-BSA 化合物具有 BSA 的特征官能团。将 NKET-BSA 与 NKET 的红外光谱进行比较，在
13、6001200 cm1 之间，出现了明显的 NKET 半抗原特征峰,而 BSA 在此处无明显吸收，说明 NKET-BSA 具有 NKET 的特征官能团,基本判断 NKET-BSA 人工免疫原已经合成成功。图 NKET，NKET-BSA 及 BSA 的 IR 图谱（略）Fig. IR spectra of NKET，NKET-BSA and BSA3.3 人工抗原偶联比的测定将所得免疫抗原（NKET-BSA）通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行偶联比的测定得测定偶联物分子量约为68685 Da，计算得 1 分子 BSA 约与 11 分子 NKET 半抗原偶联，即
14、NKET 半抗原与 BSA 的偶联比为 111。3.4 抗体效价根据方阵滴定原理，采用间接 ELISA 法测定抗 NKET 抗体的效价。当包被抗原浓度为 2.0 mg/L 时，抗血清效价可达 5.12104。本研究选择从氨基部位进行衍生化，以琥珀醛酸作为衍生剂，以混合溶剂（四氢呋喃-吡啶， 51， V/V）作为反应溶剂，低温反应得到产物。研究结果表明，本方法是一种新的 NKET 半抗原合成方法，能够满足实验室少量合成半抗原的需要。人工抗原 NKET-BSA 的合成，采用碳二亚胺法，经两步反应得到偶联物，并通过 IR 和 MALDI-TOF-MS 进行了鉴定。经动物免疫获得抗 NKET 的多克隆
15、抗体，当包被抗原浓度为 2.0 mg/L 时，抗血清效价可达 5.12104。【参考文献】1 LIU Xiao-Xing（刘小兴） ， XIONG Yong-Hua（熊勇华）.China Public Health（中国公共卫生） ， 2007， 23（5）： 6296312 White P F，Way W L，Trevor A J.Anesthesiology.，1982，56（2）: 1191363 JIANG Zhao-Lin（姜兆林） ， PAN Jun-Chang（潘俊昌） ， YAO Li-Juan（姚丽娟） ， ZHAO Yan-Jun（赵彦军）.Journal of Jiang
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