1、全反式维甲酸对兔颈动脉内皮损伤后内膜增殖和 VEGF 及 VCAM1 表达的影响作者：李彦飞 董果雄 张社华 【摘要】 目的 观察全反式维甲酸（ atRA）对兔颈动脉内皮损伤后内膜增殖和血管内皮生长因子（VEGF） 、血管细胞黏附分子1 （VCAM1 ）表达的影响。方法 新西兰雄性大白兔 36只，随机分为 6组：治疗 A、B组，对照 A、B 组，假手术 A、B 组。治疗组和对照组给予高脂饮食并行颈动脉内膜空气干燥术，假手术组手术暴露颈动脉而不损伤内膜，治疗组给予 atRA连续灌胃。分别于术后 7、28 d处死 A、B 组动物，取病变血管进行形态学观察。免疫组织化学方法检测病变血管 VEGF、V
2、CAM1表达水平。结果 假手术组动脉内膜光滑，无粥样硬化病变及 VCAM1 表达。对照组术后 7 d动脉内膜层出现泡沫细胞，平滑肌细胞增殖，VEGF、VCAM1 表达明显增加，28 d时血管内膜明显增厚，有粥样斑块形成。治疗组动脉内膜增生较轻，28 d时内膜面积低于对照组（t=4.770，P0.001） ，动脉粥样硬化病变轻于对照组（H=4.89,P0.05） ，VEGF、VCAM1 表达低于对照组（t=3.2804.288，P0.01、0.05） 。结论 atRA可抑制兔颈动脉内皮损伤后新生内膜增殖，下调 VEGF、VCAM1 表达是其作用机制之一。 【关键词】 维甲酸；血管内膜；血管内皮生
3、长因子类；血管细胞黏附分子1 血管再狭窄是 PTCA及支架植入术后主要并发症之一，生物活性因子在这一病理过程中发挥了重要作用，其中血管细胞黏附分子1 （VCAM1 ）可促进单核细胞在血管内皮的聚集、黏附、迁移，而血管内皮生长因子（VEGF）可诱导多种细胞因子、炎症因子的表达促进血管内膜损伤1。全反式维甲酸（atRA）是维生素 A的天然衍生物，近年来研究显示，它可通过调节基因转录影响细胞周期，抑制血管平滑肌细胞（SMC）的表型转化、迁移、增殖24，是一种很有潜力的抗血管再狭窄药物。为此，本实验观察了 atRA对兔颈动脉内皮损伤后内膜增殖情况及 VEGF、VCAM1 表达的影响，旨在进一步探讨其抗
4、血管再狭窄作用机制。现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料 健康雄性新西兰大白兔 36只，4 月龄，体质量（2.50.12）kg,购自青岛市动物实验中心。atRA（重庆华邦制药公司） ，胆固醇（上海化学制剂公司） ，兔抗兔 VEGF、VCAM1 、SABC 试剂盒（武汉博士德公司） ，Masson三色试剂盒（福州迈新公司） ， 奥林巴斯 BX50显微镜（日本Olympus公司） 。 1.2 动物分组及处理 36 只新西兰大白兔随机分为 6组：治疗 A、B 组，对照 A、B 组，假手术 A、B 组，每组 6只。治疗组和对照组每日进食 150 g高脂饲料（含质量分数 0.060的猪油、质
5、量分数 0.015的胆固醇、质量分数 0.925的基础饲料） ，假手术组每日喂养 150 g基础饲料，均自由饮水。治疗组术前 3 d开始每天将 atRA 6 mgkg-1溶于 1 mL植物油中灌胃至处死，对照组、假手术组给予等量植物油灌胃。喂养 2周后行颈动脉内膜空气干燥术。治疗组、对照组手术严格无菌操作，经耳缘静脉注射 250 g/L的乌拉坦 1.0 g/kg麻醉动物，取颈部正中纵形切口，分离右颈总动脉长2.0 cm, 选择无分支段，动脉夹夹闭两端，4.5 号针头平行穿刺阻断血管的两端，9 g/L的氯化钠注射液冲洗血管腔，向夹闭段的颈总动脉内以120 mL/min流量注入空气，共 10 mi
6、n，管腔内重新注入生理盐水，放开动脉夹，压迫止血，观察血流通畅后逐层缝合。假手术组手术至暴露颈动脉，不行损伤内膜操作。术后各组每天肌注青霉素 40万单位，连续 3 d。分别于术后第 7、28 天处死 A、B 组动物，取病变部位血管等距切分35 段，40 g/L 的中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋。 1.3 血管组织形态学测定及病变观察 血管标本横截面连续切片，厚度 4 m。切片行苏木精 伊红（HE）及 Masson染色，显微镜下观察血管结构，进行图像分析，测定每张切片上各个血管截面的内膜面积、中膜面积，计算内膜/中膜面积比，取平均值，用以评定血管狭窄程度。镜下观察术后 28 d血管组织切片动脉粥样硬
7、化（AS）病变情况，按照美国心脏病学会对 AS的分期（、期）标准，以最重病变为准，对每例动物病变进行分期，计数每组动物各期病变例数。测量 AS病变最厚处内弹力板至腔面垂直距离，作为该例动物的最大斑块厚度。 1.4 免疫组化染色检测 VEGF、VCAM1 表达 病变血管用 SABC三步法进行 VEGF、VCAM1 免疫组化染色，体积分数 0.03的过氧化氢灭酶，微波修复，一抗稀释度均为 1200，室温孵育1 h，DAB 显色，苏木精复染。PBS 代替一抗作阴性对照。显微镜下观察蛋白表达情况，VEGF 在胞膜及胞浆表达，VCAM1 表达于胞膜。随机测量每张切片中 6个高倍视野的阳性部位平均吸光度和
8、阳性面积百分比，取其平均值，二者乘积乘以 100为阳性表达指数。 1.5 统计学处理 计量资料数据以s 表示，使用 SPSS 11.0统计软件进行 t检验或方差分析；计数资料比较采用 H检验，P0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 血管组织形态和 AS病变情况 实验动物无死亡或患病的情况，切口愈合良好。假手术组颈动脉内膜光滑，7 和 28 d血管结构无明显差别，内皮细胞完整，呈单层紧贴内弹力板，中膜血管 SMC环形规则排列。对照组术后 7 d时血管内皮再生，尚未完全覆盖管腔，内弹力板多处断裂，有 SMC迁移入内膜，内膜层出现泡沫细胞。28 d时镜下可见内膜层有大量 SMC增生，排列
9、紊乱，泡沫细胞聚集,有脂质池、脂质核心形成，中膜亦出现泡沫细胞，动脉内膜明显增厚，并可见粥样硬化偏心性狭窄。治疗组病变与对照组相似，但程度较轻，内膜增厚明显轻于对照组。术后 28 d时对照组有 1例期 AS病变，5 例期 AS病变，治疗组有 5例期 AS病变，1 例期 AS病变，治疗组病变轻于对照组（H=4.89,P0.05） 。对照组斑块厚度（0.210.09）mm，治疗组为（0.090.04）mm，治疗组斑块厚度低于对照组，差异有显著意义（t=2.87,P0.05） 。 术后 7 d时治疗组内膜面积、内膜/中膜面积比与对照组比较，差异无显著意义(t=1.004、1.502,P0.05)；术
10、后 28 d时治疗组内膜面积、内膜/中膜面积比均低于对照组（t=4.770、5.092，P0.001） 。术后7、28 d 时各组间中膜面积比较无明显差异(F=1.723、1.234,P0.05） 。见表 1。 2.2 atRA 对血管 VEGF、VCAM1 表达的影响 假手术组动物术后 7、28 d仅血管内皮有微量 VEGF表达；对照组术后 7 d 在血管新生内皮层和中膜 SMC有 VEGF表达，部分融合成片，术后28 d时阳性表达指数下降，新生内膜、中膜、外膜均有表达，以新生内膜深面靠近内弹力板处、粥样硬化斑块部位为主，可见泡沫细胞表达。治疗组术后 7、28 d时 VEGF表达部位及规律与
11、对照组相同，但阳性表达指数低于对照组（t=3.280、4.288,P0.01） 。见表 2。 假手术组血管未见 VCAM1 表达，对照组术后 7 d时血管内膜、中膜可见大量棕黄、棕褐色颗粒，呈网格状，部分融合成片，以内膜为主，内皮细胞及泡沫细胞表达明显；术后 28 d时表达下降，血管各层均可见棕黄色物质，以新生内膜深面、粥样硬化病灶处为主。治疗组血管VCAM1 表达部位及规律与对照组一致，但阳性表达指数明显低于对照组（t=2.818、3.703，P0.05） 。见表 2。 表 1 各组内膜面积、中膜面积及内膜/中膜面积比结果比较（略） 表 2 atRA对血管 VEGF、PCNA 阳性表达指数影
12、响（略） 3 讨论 VCAM1 是与炎症有关的重要的黏附分子，其配体是整合素家族的VLA4 ，通过与 VLA4 结合介导细胞与细胞之间的黏附。VCAM1 参与AS形成过程中所涉及的炎症细胞聚集，促进单核细胞黏附、迁移并转化为巨噬细胞，同时还可促进 T淋巴细胞及 B淋巴细胞从血流中向内皮细胞的黏附。VCAM1 在 PTCA术后再狭窄中也发挥了重要作用，它可刺激SMC迁移，加重单核 巨噬细胞浸润及内膜增殖，而应用 VCAM1 抗体能使小鼠动脉损伤模型的新生内膜增厚明显减轻5,6。 本实验中对照组血管内皮细胞、SMC 和泡沫细胞 VCAM1 表达明显增高，局部呈现炎症状态，这些细胞的黏附、迁移功能增
13、强，促进了血管内膜增殖及 AS病变形成。治疗组在应用 atRA后明显抑制了 SMC的迁移、增殖，减轻了内膜增厚和 AS进展，这与其下调损伤血管的 VCAM1 表达有关。研究结果表明，atRA 能抑制 NFB 的活化，而 NFB 是VCAM1 重要的转录调节因子，NFB 活化可使其过度表达，引起炎症反应7。血管内膜损伤可引起多种细胞因子分泌，包括 TNF、IL1等，atRA 还能抑制 TNF 诱导的 VCAM1 表达7。atRA 抑制 VCAM1表达可能是这些机制的综合结果。 VEGF 是重要的促有丝分裂素，可刺激内皮细胞的增生、迁移，促进血管内皮修复，而血管内皮的完整对抑制再狭窄和血栓有益。但
14、 VEGF还是重要的血管通透性因子，可导致血浆蛋白渗漏，炎症细胞在局部聚集，促进 AS斑块内微血管形成，使斑块不稳定性增加8。另外，其还可诱导单核细胞的活化、迁移及多种细胞因子、炎症因子的表达，促进血管内膜损伤1。所以，从某种意义上说 VEGF也是一种促炎症因子。 本实验结果显示，在高胆固醇饮食和内膜损伤刺激下，血管的内膜、中膜 VEGF异常表达，术后 28 d时内皮细胞已完全覆盖腔面。VEGF 处于一种过度表达状态，这种持续过高的分泌状况诱导了其他炎性因子的作用，加剧了内膜的损伤和内膜增殖。本实验中 atRA显示了抗内膜增殖和AS作用，这一作用与 atRA抑制 VEGF的表达，减轻 VEGF
15、导致的炎症细胞聚集及炎症因子表达有关。atRA 下调 VEGF表达可能是在基因水平抑制VEGF转录，以及抑制其他促 VEGF分泌因子作用的综合结果9。 本实验结果表明，在高脂饮食及内皮损伤等因素作用下，血管组织VEGF和 VCAM1 持续、过多地表达，与多种生物活性因子相互作用，最终促进了内膜过度增殖及血管再狭窄病变形成。应用 atRA能明显抑制 AS进展和血管再狭窄的发生，而抑制 VEGF和 VCAM1 表达是其机制之一。 【参考文献】 1KISHO O, KENSUKE E, KENICHI H, et al. Blockage of vascular endothelial growth
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