1、全反式维甲酸对兔颈动脉粥样硬化病灶VSMC 增殖及 AKT1 表达影响作者：张青青 董果雄 张社华【摘要】 目的 探讨全反式维甲酸 (atRA)对兔颈动脉内膜损伤后内膜增生以及蛋白激酶 B(AKT1)、增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响和机制。方法 新西兰雄性大白兔 36 只，随机分为 6 组：假手术 A、B 组,手术A、B 组,手术并予 atRA 治疗 A、B 组（治疗 A、B 组） ，每组各 6 只。各组均给予高脂饮食 14 d 后，手术组作颈动脉内膜损伤模型。治疗组于术前3 d 开始每天给予 atRA 灌胃，其余操作同手术组。假手术组手术但不损伤内膜。于术后 7 d 处死 A 组动物，
2、 28 d 处死 B 组动物。采取颈动脉标本，对血管粥样硬化病变进行大体形态学观察，用免疫组化法检测粥样硬化病灶中 AKT1、PCNA 的表达水平。结果 手术组术后 7 d 内膜开始增生， 28 d 时增生明显，粥样斑块形成，管腔狭窄，AKT1、 PCNA 阳性表达明显。治疗组内膜增生较轻， 28 d 时，内膜面积及斑块厚度低于手术组(t=3.797、3.704,P0.01)，AKT1、PCNA 阳性表达指数亦低于手术组(t=4.741、2.890,P0.05)。结论 atRA 能抑制兔颈动脉内皮损伤后AKT1、PCNA 的表达，抑制平滑肌细胞增殖，从而抑制内膜增生及动脉粥样硬化病变进程。 【
3、关键词】 维甲酸；肌细胞,平滑肌；冠状动脉再狭窄；原癌基因蛋白质 caktABSTRACT Objective To investigate the influence of alltrans retinoic acid (atRA) on intima proliferation and expressions of AKT1 and PCNA in rabbit carotid artery after endomembrane injury. Methods Thirtysix New Zealand rabbits wereevenly randomized to six groups
4、: shamoperation group A and group B; operation group A and group B; and treatment group A and group B. All the rabbits were fed with high fat diet for 14 days. A model of carotid artery endomembrane injury was created in operation group. In treatment groups, rabbits were lavaged with atRA daily for
5、3 days before operation. Those in shamoperation groups underwent surgery without injuring the endomembrane. Rabbits in groups A were killed 7 days after operation and those in groups B, 28 days. Carotid specimens were taken for gross examination and immunohistochemistry study used for detection of t
6、he expressions of AKT1 and PCNA proteins. Results Seven days after operation, neointima formation was found in carotid artery in the operation group, and it became obvious afetr 28 days with atherosclerosis plaque, narrowing of arterial lumen and expressions of AKT1 and PCNA. In the treatment group,
7、 there was mild intima proliferation, and, 28 days after surgery, the intima area was smaller and the plague was thinner than that of the operation group (t=3.797, 3.704;P0.01). The index of positive expressions of AKT1 and PCNA in the treatment group was also lower than that of the operation group
8、(t=4.741, 2.890;P0.05). Conclusion atRA can suppress the expressions of AKT1 and PCNA in injured endomembrane of rabbit carotid artery, inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells, and therefore inhibit neointima proliferation and progression of atherosclerosis.KEY WORDS tretinoin; myo
9、blasts, smooth muscle; coronary restenosis; protooncogene proteins cakt经皮冠状动脉成形术(PTCA)及支架植入术已被广泛用于冠状动脉粥样硬化性心脏病的治疗，然而其术后的再狭窄（RS）问题影响了其远期疗效。再狭窄是受损内膜增生的表现,其主要病理机制则是血管平滑肌细胞（VSMC）的过度增殖。全反式维甲酸(atRA)是维生素 A 的天然衍生物，近年来研究发现它可抑制 VSMC 的表型转化、迁移，调节细胞内信号转导通路及细胞周期进程，从而影响新生内膜形成的多个环节12 。蛋白激酶 B(AKT1)是细胞内信号转导通路中重要的信号分子
10、，调控细胞多种基本功能，尤其在细胞增殖和存活方面发挥着关键作用。本文旨在进一步探讨 atRA 抑制 VSMC 增生、预防 RS 发生的机制，为临床选药提供依据。1 材料和方法1.1 动物分组及模型制作新西兰雄性大白兔 36 只，青岛市动物实验中心提供，4 月龄，体质量（2.500.12）kg。随机分为 6 组：治疗 A 组，治疗 B 组，手术 A组，手术 B 组，假手术 A 组，假手术 B 组。治疗组和手术组每日进食 150 g 高脂饲料（每 100 g 饲料含猪油 6.0 g,胆固醇 1.5 g,基础饲料 92.5 g。 ） ，假手术组每日进食 150 g 基础饲料，均自由饮水。各组动物饲养
11、 14 d 后在无菌操作下进行手术：手术组行颈动脉内膜空气干燥术，治疗组于术前 3 d 开始给予 atRA(重庆华邦制药公司) 6 mgkg-1 d-1 灌胃，其余操作同手术组。假手术组分离颈动脉但不损伤内膜。各组术后每天肌注青霉素 40 万单位，连续 3 d。分别于术后 7 d 时处死 A 组动物，28 d 时处死 B 组动物，取病变部位血管等距切分 45 段，40 g/L 中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋，血管标本横截面切片(3 m)。1.2 血管形态学及动脉粥样硬化病变检测术后取出血管段，先进行大体肉眼观察。蜡块标本切片行苏木精 伊红染色（HE 染色） ，显微镜下观察血管结构，采用图像分析软件
12、ImagePro Plus(IPP)进行图像分析，测定各个血管截面的内膜面积(IA)、中膜面积(MA)，计算内膜/中膜面积比（I/M)、管腔狭窄度(LSD)。LSD =内膜面积/内弹力板下面积100，取平均值。取术后 28 d 切片，显微镜下观察动脉粥样硬化病变情况，根据 AHA 对动脉粥样硬化的分期(、期)计数每期发生动物例数，以最重病变为准，测量动脉粥样硬化病变最厚处内弹力板至腔面垂直距离，作为该动物的最大斑块厚度。1.3 AKT1 和增殖细胞核抗原(PCNA)表达检测采用免疫组织化学二步法行 AKT1（即用型兔抗兔 AKT1，武汉博士德公司)免疫组化反应，工作液未做稀释，二抗采用 PV6
13、001 试剂盒(北京中杉公司)，DAB 显色，苏木精复染，胞质呈棕黄、棕褐色为阳性。以PBS 代替一抗作阴性对照。用 IPP 进行图像分析，随机测量每张切片中 6个高倍视野的阳性部位平均吸光度（A）和阳性面积百分比，取其平均值。AKT1 阳性表达指数=平均吸光度（A）平均阳性面积百分比100。用二步法进行鼠抗兔 PCNA（北京中杉公司）染色，一抗稀释度为 1100，显色步骤同 AKT1。采用 IPP 进行图像分析，随机测量每张切片 6 个高倍视野的阳性胞核占总胞核比例及阳性胞核平均光吸光度（A） ，计算 PCNA 阳性表达指数。PCNA 阳性表达指数=平均阳性胞核比平均吸光度（A）100。1.
14、4 统计学处理使用 SPSS 13.0 和 PPMS 1.53统计学软件进行数据处理，计量资料结果以s 表示，数据间比较采用 t 检验，计数资料比较采用等级分组资料 H 检验。2 结 果2.1 肉眼观察所有动物无患病、死亡。术后未发现感染，创口愈合良好。假手术 A、B 组内膜光滑。手术 A 组内膜可见脂点、脂纹及斑块，B 组内膜明显增厚，表面不平整，斑块长短不一，隆起于内膜表面。atRA 治疗 A 组内膜可见有脂点、脂纹形成，B 组内膜可见斑块形成但较手术 B 组轻。2.2 光学显微镜观察假手术 A、B 组动脉内皮细胞结构完整,单层规则排列，紧贴于内弹力板；内弹力板结构完整，中膜层厚度均匀，基
15、质匀称，VSMC 呈环形规则排列，胞内可见梭形的细胞核，排列方向一致，两组无明显差异。手术 A 组管腔内皮开始增生，多为单层内皮细胞，局部呈多层，内弹力板模糊，多处可见断裂，平滑肌细胞穿过内弹力板，中膜层间隙增宽，细胞外基质增多，细胞数增多，排列紊乱，内弹力板下尤为明显；手术B 组管腔内凹凸不平，粥样斑块向管腔隆起，内皮下可见脂质池形成，内膜增厚明显，内皮细胞大量增生，泡沫细胞形成，平滑肌细胞增生移行明显。atRA 治疗组与手术组病理变化相似，治疗 A 组可见有内皮增生，内弹力板有断裂，较手术 A 组轻；治疗 B 组内膜增厚程度、平滑肌细胞增生移行程度较手术 B 组亦轻。2.3 各组 IA、I
16、/M 和 LSD 比较治疗 A 组 IA、I/M、LSD 与手术 A 组比较，差异无统计学意义（t=0.4981.446,P0.05） ；治疗 B 组 IA、I/M、LSD 均低于手术 B组（t=3.797 6.893,P0.01） 。见表 1。表 1 各组 IA、MA、I/M 及LSD 值比较（略）2.4 各组动脉粥样硬化病变情况比较术后 28 d 时手术组有 1 例观察到期病变，5 例观察到期病变；治疗组有 5 例观察到期病变，1 例观察到期病变，治疗组病变较手术组轻，差异有显著性(H=4.89，P0.05)。斑块厚度手术组为(0.190.06)mm，治疗组为(0.090.03)mm，两组
17、比较，差异有显著性(t=3.704，P0.01)。2.5 各组 AKT1、PCNA 表达的比较假手术 A、B 组 AKT1 仅在血管内皮细胞胞质有微量表达；手术 A组 AKT1 在内膜增生处内膜层和中膜层高度表达，内皮细胞、平滑肌细胞及泡沫细胞的胞质、胞核均有表达，主要表达于胞质；手术 B 组 AKT1 阳性表达指数在增生内膜层与中膜层均下降，以粥样斑块深面内弹力板周围表达明显；治疗 A、B 组 AKT1 表达规律与手术组相同，但 AKT1 的阳性表达指数低于手术组，差异均有极显著意义（t=5.180、3.361，P0.01） 。假手术组偶见微量 PCNA 表达；手术组PCNA 在新生内膜和中
18、膜强表达，主要表达于细胞核；治疗组 PCNA 表达部位及规律与手术组一致，但治疗 A、B 组 PCNA 阳性表达指数均低于手术A、B 组（t=4.741、2.890，P0.01、0.05） 。见表 2。表 2 各组AKT1 和 PCNA 阳性表达指数比较（略） 3 讨 论RS 的主要机制之一就是 VSMCs 的过度增殖。抑制 VSMCs 异常增殖成为预防 RS 的主要手段。近年来研究发现，atRA 对 PTCA 术后 VSMCs 具有明显抑制作用，是一种很有前景的防治 RS 发生的药物。本课题组前期实验证实，atRA 可抑制平滑肌细胞的增殖。本实验的目的是进一步研究atRA 抑制细胞增殖的机制
19、。组织的稳态是内环境中各种因素影响细胞的增殖活动和凋亡活动，使两方处于动态平衡的结果。任何一方面被过度激活或抑制都会打破这个平衡，使组织表现为增殖或者凋亡。因此，VSMCs 的增殖和凋亡与 RS的发生发展密切相关。抑制平滑肌细胞的增殖和促进其凋亡成为目前防治血管异常增生性疾病的两个重要手段。而在调控细胞生物活动尤其是增殖和凋亡的复杂的信号转导网络中 AKT 起到了枢纽作用。AKT 又称作 PKB（蛋白激酶 B） ，属于丝 苏氨酸蛋白激酶，是细胞内重要信号分子，PI3K 是主要调节 AKT 活性的物质，因此 AKT 主要参与PI3KAKT 信号转导通路，通过影响下游多种效应分子的活化状态在细胞多
20、种生理、病理过程中发挥重要作用。哺乳动物 AKT 至少包括 3 种亚型：AKT1、AKT2、AKT3，研究表明其与细胞增殖、存活、分化、凋亡、迁移等多种生物学活动有关。其中，AKT1 主要促进细胞存活和增殖。PI3KAKT 途径可以被多种细胞内的刺激因子以及有毒物质，如PDGF、VEGF、IGF1 、Ang、eNOS 等所活化,并可促使其迁移至细胞核内。AKT 的异常活化与多种疾病的发展有关，尤其是增殖性疾病如肿瘤，其实质是细胞增殖与凋亡失去平衡，而正是 AKT 途径联系了这两个事件，而且起到了主要的作用，这种作用表现为负性调节细胞凋亡，正性调节细胞增殖。一方面，AKT 具有抗细胞凋亡的作用。
21、活化的 AKT 可以使BAD（Bcl2 家族） 、BAX（Bcl2 家族） 、caspase9 、 Par4 磷酸化，发挥抗凋亡作用46 ；影响转录因子家族 Forkhead、NFB 、P53 等，发挥细胞存活调控作用7；另外，AKT 还通过代谢途径调节细胞凋亡。另一方面，AKT 具有促进细胞增殖作用，其主要通过调控细胞周期实现。AKT 可以与 P21、P27 结合并将其磷酸化，使 P27 水平下降，阻断其抑制cyclinE 及 CDK2 作用。AKT 还可以在 S2M 期活化 cyclinB CDC2。另外，AKT 还通过磷酸化 mTOR 促进增殖相关基因 mRNA 的大量转录，合成生长增殖
22、所需蛋白，加速细胞的增殖8。提示 AKT 在调节细胞增殖方面发挥着重要作用，其在细胞内高表达提示细胞处于过度增殖状态。本实验结果显示，AKT1 在正常兔颈动脉仅内皮细胞胞质少量表达,平滑肌细胞不表达；高脂饮食和内膜损伤 7 d 后，内膜层内皮细胞、平滑肌细胞和中膜层平滑肌细胞均大量表达；28 d 后，内膜层和中膜层表达虽均有所下降，但阳性表达指数仍较高。PCNA 的表达规律与其相同，而 PCNA 则是反映细胞增殖程度的可靠指标。由此可见，AKT1 的表达与VSMCs 的过度增殖密切相关，可能是调控 VSMCs 增殖的主要信号分子。本文研究结果还显示，治疗 B 组与手术 B 组比较，IA、I/M
23、、LSD 以及最大斑块厚度均有明显下调，差异有统计学意义。说明 atRA 可下调内膜增生血管内膜层以及中膜层平滑肌细胞 AKT1 及 PCNA 的表达。提示 atRA 具有抑制内膜损伤后增生，抑制动脉粥样硬化斑块发展的作用。这种抑制作用可能与其抑制 AKT1 的表达，从而抑制平滑肌细胞过度增殖有关。【参考文献】1褚现明,钟志欢,王国栋,等. 全反式维甲酸对球囊损伤大鼠胸主动脉 VSMC 表型变化及增殖的影响J. 青岛大学医学院学报, 2005,41(4)：297299. 2张社华,王旖旎,郭琳琳,等. 全反式维甲酸对兔颈动脉粥样硬化病灶 VSMC 增殖信号传导途径的影响J. 中国分子心脏病学杂
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