1、缺氧对视网膜 Mller 细胞超微结构及 GFAP表达的影响作者：苟琳 张作明 郭守一 张萍 李莉 郭群 【关键词】 神经胶质酸性蛋白 关键词: 低氧;Mller 细胞;超微结构;神经胶质酸性蛋白;细胞，培养的 摘 要:目的 探讨持续低流量缺氧条件下视网膜 Mller 细胞超微结构的改变及缺氧对神经胶质酸性蛋白（GFAP）表达的影响. 方法 采用透射电镜、western blot 方法对缺氧条件下培养的视网膜 Mller 细胞进行观察. 结果 缺氧 48h 后，视网膜 Mller 细胞的超微结构发生改变，细胞内 GFAP 表达较对照组增高. 结论 持续低流量缺氧 48h，即可对视网膜 Mlle
2、r 细胞造成一定的损伤. Keywords:hypoxia;Mller cells;ultrastructure;glial fibril-lary acidic protein;cells，cultured Abstract:AIM To study the effects of hypoxia on the ultra-structure and GFAPs expression of Mller cells.METHODS Transmission electron microscope and western-blot tech-nique were used to observe t
3、he Mller cells cultured at hy-poxia condition.RESULTS After48h of hypoxia，the reti-nal Mller cellsultrastructure apparently changed and the glial fibrillary acidic protein（GFAP）had an increased ex-pression compared to the control group.CONCLUSION Certain lesion would happen to the retinal Mller cell
4、s when they were insulted by48h hypoxia. 0 引言 视网膜 Mller 细胞是一种特化的神经胶质细胞，具有维持视网膜的正常结构、营养视网膜神经元、参与构成血-视网膜屏障等多种生理功能，而且还参与视网膜的多种病理生理过程1，2 .视网膜组织对缺氧非常敏感，许多视网膜病变是由急性或慢性组织缺血缺氧所致.以往的研究多侧重于视网膜神经元及色素上皮细胞对缺血缺氧的反应，而对视网膜Mller 细胞在缺氧条件下的反应和变化研究较少.视网膜 Mller 细胞作为视网膜主要的营养和支持细胞，探讨其在缺氧条件下在视网膜病理变化过程中的可能作用，将为进一步了解缺氧条件下视网膜
5、的病理反应机制提供新的实验依据. 1 材料和方法 1.1 视网膜 Mller 细胞的培养与鉴定 条件培养基的制备:每 100mL 条件培养基中加 20mL Con A 活化上清液 3 ，20mL 加强型小牛血清，60mL DMEM/F12 培养液，青霉素 100U mL-1 ，庆大霉素 10U mL-1 . 视网膜 Mller 细胞的制备:将出生 57d 的 SD 大鼠（由第四军医大学实验动物中心提供）麻醉处死，摘取眼球，移入超净台，在 750mL L-1 乙醇中浸泡 1020s，用 D-Hanks 液冲洗数遍，在解剖显微镜下去除眼前节，剥取视网膜.将视网膜剪碎，并用 0.5g L-1 胰蛋白
6、酶消化10min，Hanks 液终止消化，反复吹打细胞制成细胞悬液，经 400 目筛网过滤，以 800r min-1 离心 5min，弃上清，用条件培养基调整细胞密度为 3108 L-1 ，接种于塑料培养皿内，于 3750mL L-1 CO2 培养箱内培养，24h 后换液，以后每 3d 换液一次，待细胞长至融合以 1 2 方式进行传代培养. 视网膜 Mller 细胞的鉴定:预先在培养皿中置入盖玻片，待细胞贴壁融合后，将上述长有 35 代细胞的盖玻片取出，40g L-1 多聚甲醛固定 30min，30mL L-1 H2 O2 作用 15min 封闭内源性过氧化物酶，用 ABC法进行神经胶质酸性蛋
7、白（glial fibrillary acidic protein）染色，DAB 显色. 1.2 缺氧条件的建立 将传至 35 代即将融合的 Mller 细胞随机分为两组，一组为实验组，一组为对照组，实验组置于缺氧（50mL L-1 CO2 ，50mL L-1 O2 ，900mL L-1 N2 ）环境中4 ，给气方式采用持续低流量通气，约 50mL min-1 ;对照组置于正常（50mL L-1 CO2 ，950mL L-1 空气）环境中，培养 48h 后取出.分别进行超微结构和 GFAP表达的测定. 1.3 超微结构观察 即刻收集实验组和对照组细胞， 25mL L-1 戊二醛预固定，10g
8、L-1 锇酸后固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂 812 浸透包埋，超薄切片.枸橼酸铅和醋酸双氧铀双重电子染色，透射电子显微镜观察. 1.4 GFAP 表达观察 即刻收集实验组和对照组细胞，每组约 1107 个，加入匀浆缓冲液，将细胞置于冰浴中，超声波粉碎，冰浴 20min 后，13000g 离心（4，20min）.取上清加入等体积 2SDS-PAGE 样品缓冲液，在沸水中煮 510min 使之变性，进行总蛋白定量.将总蛋白量相等的实验组和对照组样品上 50g L-1 浓缩胶，120g L -1 分离胶，行常规 SDS-PAGE 电泳.取出 SDS-PAGE 凝胶，将其转移至 NC膜上.转移后取出
9、NC 膜，浸于丽春红 S 工作液中 1min，去离子水漂洗 2次，剪下 Marker 用考马斯亮蓝染色，其余部分用 ABC 方法行 GFAP 染色.显色时待区带清晰，立刻将 NC 膜浸入去离子水中，终止显色. 图 1 图 5 略 2 结果 2.1 培养的视网膜 Mller 细胞生物学特性 原代培养的视网膜 Mller 细胞接种后 24h 即可贴壁，第一次换液时可将漂浮的及贴壁不牢的细胞洗掉，剩下的细胞则大多数为 Mller 细胞，同时还混杂有部分神经元细胞.原代细胞生长 710d 即可长满，随后按照 1 2 方式传代，传至 3 代以后即可得到较纯的视网膜 Mller 细胞.原代培养的细胞胞体较
10、小，连接紧密，多呈不规则形状，折光性暗，镜下可见细胞分成两层，上层细胞胞体小，折光性强，可带有突起.下层细胞胞体大，折光性暗，相互间界限不清.传代后细胞呈单层，胞体变大，折光暗，可见粗大突起.选取 35 代的细胞进行 GFAP 染色，阳性细胞在 90%以上（Fig1）. 2.2 电镜观察结果 对照组视网膜 Mller 细胞核仁较明显，线粒体狭长，嵴较多，有发达的高尔基体和散在的溶酶体，粗面内质网结构清晰（Fig2）.缺氧组的 Mller 细胞胞核内异染色质呈斑块状，大部分于核周边凝集，滑面内质网膨大并充满匀质性物质（Fig3）;多数细胞线粒体由狭长形变为圆形，嵴排列疏松（Fig4）;细胞胞质及
11、细胞微绒毛内有大量糖原堆积（Fig5）. 2.3 Western blot 结果 用 GFAP 的特异性抗体进行的 western blot 观察，可发现缺氧组和对照组在 Mr 49103 处均有 GFAP 蛋白表达，但缺氧组表达明显较对照组高（Fig6）. 图 6 视网膜 Mller 细胞表达 GFAP 的 western blot 结果 略 3 讨论 Mller 细胞是视网膜内的一种特殊类型的神经 胶质细胞，主要作用是对视网膜内各种神经元起营养和支持作用，同时参与调节神经突触传递，也是构成血-视网膜屏障的重要成分.近年来，越来越多的研究表明，Mller 细胞还在视网膜内的多种疾病的病理进程
12、中起重要作用2 .本实验中，我们采用体外培养的 Mller 细胞作为模型，运用低流量持续缺氧模拟视网膜慢性缺血时的在体环境，观察了在正常和缺氧条件下，Mller 细胞的超微结构变化和细胞骨架蛋白 GFAP 的变化情况. 缺血缺氧可以导致视网膜内细胞超微结构发生改变，电镜观察发现由高眼压引发的视网膜缺血会导致视网膜细胞的凋亡和二次坏死5 .本实验中，我们通过电镜观察到在慢性低流量缺氧条件下 Mller 细胞的超微结构发生了明显的改变，主要表现为:Mller 细胞胞核内异染色质呈斑块状，大部分于核周边凝集;多数细胞线粒体肿大，嵴排列疏松;内质网扩张等.这些改变和以往的报道相符5 .但在本实验中发现
13、，缺氧后在细胞胞质尤其是在微绒毛内糖原的分布较对照组明显增多，同时在内质网内可见蓄积的均质性物质，提示在慢性缺氧条件下，Mller 细胞的代谢情况发生了改变.这种改变是慢性缺氧条件下 Mller 细胞的适应性反应还是细胞凋亡的前期反应，与在体条件下慢性缺氧导致细胞代谢的变化是否相同，尚待进一步研究. 缺氧不仅引起 Mller 细胞的代谢发生变化，还可导致细胞骨架成分的改变.GFAP 是一种中间丝蛋白，是构成细胞骨架的一种蛋白成分，在视网膜内，通常仅神经节细胞/神经纤维层的星形胶质细胞表达 GFAP.但当大鼠眼压升高引发的缺血再灌注后 GFAP 会持续增高 2wk，并引发 Mller细胞表达 G
14、FAP，这一过程与神经细胞的损伤过程相当6 .通常，中枢神经系统受到损伤后，胶质细胞的 GFAP 表达均会有急剧的上升，并且从损伤区向周围扩展，表达的水平同损伤的严重程度有关7 .以往的研究表明，正常在体条件下，Mller 细胞 GFAP 的表达是很微弱的，而各种损伤刺激，均会使 Mller 细胞的 GFAP 表达有很大增强8 .我们通过western blot 的方法发现，培养的 Mller 细胞通常会有少量 GFAP 的表达，在缺氧以后，Mller 细胞的 GFAP 表达明显增加.本实验中，Mller细胞在缺氧作用结束时，细胞并未大量死亡，但细胞的超微结构发生了改变，这一形态变化同 GFA
15、P 的高表达有关，并可能参与缺氧损伤时Mller 细胞的增殖反应9 . 本研究结果表明，在慢性缺氧实验条件下，视网膜 Mller 细胞的超微结构和细胞骨架都会发生变化，这种变化对维持视网膜神经细胞的正常功能有何意义是一个值得研究的问题. 参考文献: 1Arroyo JG，Ghazvini S，Char DH.An immunocytochemical study of isolated human retinal Muller cells in culture J.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，1997;235（7）:411-414. 2Newman E，R
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