1、人 FLT3 配体的克隆、表达与纯化作者：吴成利 师建国 颜真 韩苇 石继红 张英起 【关键词】 基因表达 关键词: 配体;克隆，分子;基因表达;蛋白纯化 摘 要:目的 克隆人 FLT3配体（Flt3Ligand，FL）基因，并在大肠杆菌中对 FL进行表达、纯化. 方法 分离人外周血单个核细胞，提取总RNA，采用 RT-巢式 PCR扩增人 FLT3配体胞外段基因，以双脱氧终止法进行 DNA序列分析;将测序正确的目的基因克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-B;重组质粒 pRSET-B-FL转化大肠杆菌 BL21（DE3） ，用 IPTG进行诱导后，收集细菌，菌体裂解后，利用常压离子交换色谱的方
2、法对表达蛋白进行纯化，并进行 SDS-PAGE及 Western-blot检测. 结果 从人外周血单个核细胞中克隆得到长 462bp的 FL基因，测序正确;经 EcoR和Hind酶切鉴定证实，FL 成功地克隆到表达载体 pRSET-B;构建的表达载体 pRSET-B-FL在大肠杆菌中表达出 Mr24000的融合蛋白，经常压离子交换色谱化后的融合蛋白的纯度达到 90%，该融合蛋白具有 FL抗原特性. 结论 成功地克隆并表达了 FL基因，并对融合蛋白进行了初步纯化，为大规模获得 FL创造了条件. Keywords:ligands;cloning，molecular;gene expression;
3、protein purification Abstract:AIM To clone human FLT3ligand gene，express FL protein in E.coli and purify it preliminarily.METHODS A cDNA encoding soluble FL was cloned through RT-nest-ed PCR from the total RNA extracted from human peripheral blood mononuclear cells and identified by analyzing the nu
4、-cleotide sequences.The human FL gene was subcloned into the expressing vector pRSET-B.The recombinant plasmid pRSET-B-FL was transformed to BL21（DE3） ，and then FLT3ligand was expressed under the inducement of IPTG.The fused protein was purified by ion exchange methods of SP-Sepharose Fast Flow and
5、Q-Sepharose Fast Flow.SDS-PAGE and Western-blot were employed to identify the ex-pression of human FLT3ligand.RESULTS FL gene with a length of462bp was isolated from human peripheral blood mononuclear cells.Sequence analysis revealed the sequence of FL gene was consistent with relevant reports.FL ge
6、ne was cloned into the expressing vector pRSET-B identified by enzyme digestion of EcoRand Hindenzyme.SDS-PAGE showed that a Mr24000fused protein was expressed in E.coli.The purity of the fused protein obtained by ion exchange method was90%.Wenstern-blot showed the fused protein could be recognized
7、by the anti-FL antibody.CONCLUSION The FL gene was obtained by RT-PCR amplification.The expressing vector of FL was successfully constructed and ex-pressed in E.coli.The fused protein was purified preliminari-ly.The study will provide necessary conditions for obtaining rhFL protein on a large scale.
8、 0 引言 Flt3 配体（Flt3Ligand，FL）是一种早期造血生长因子.FL 单独作用，对刺激造血的效果不明显，但它与 IL-6（白细胞介素 6） ，G-CSF（粒细胞集落刺激因子） ，GM-CSF（粒-巨噬细胞集落刺激因子）和SCF（干细胞因子）等细胞因子协同作用时，具有刺激造血干/祖细胞增殖的活性1-4 .目前研究发现，FL 刺激机体产生大量树突状细胞5-7 ，从而诱导体内特异的抗肿瘤免疫，可抑制肿瘤的生长8，9 .并且，FL 在辐射防护方面也有一定作用10 .由此可见，FL 在干细胞体外扩增移植、外周血干细胞动员、临床肿瘤免疫治疗和辐射防护等方面具有诱人的应用前景.所以，获得人
9、FLT3配体胞外段 cDNA以便进行原核表达得到 FL蛋白质极为重要.我们以人外周血单个核细胞为来源，克隆得到 FL基因，并实现其原核高效表达，摸索了 FL蛋白初步纯化的条件，为其大规模制备及其应用奠定了基础. 1 材料和方法 1.1 材料 健康人外周血（西京医院血库）.TaqDNA 聚合酶、EcoR，BamH，Hind内切酶、T4DNA 连接酶、逆转录酶、RnaseH，oligo（dT）12-18 ，DNA marker、蛋白 marker，NucleoTrap Gel Extraction试剂盒、测序试剂盒均为 Takara公司产品.SP-Sepharose FF及 Q-Sepharose
10、 FF购自 Pharmacia公司.DTT 为 Serva公司产品.pGEM-3ZF（-）克隆质粒和表达质粒 pRSET-B均为本教研室保存，其余试剂为国产分析纯. 1.2 方法 1.2.1 反转录 cDNA第 1链 取健康人外周血，分离单个核细胞5 .提取总 RNA.总 RNA5g 加 oli-go（dT） 12-18 0.5g，以 DEPC处理水补足体积至 25L，于 70水浴放置10min，然后迅速转移至 50;向上述样品中加入 25L42预热的反应混合物（DEPC 处理水 7.5L，10PCR 缓冲液 5L，25mmolL-1 MgCl2 5L.10mmolL-1 4dNTPs2.5L
11、，0.1molL-1 DTT5L）和 3.3kat 逆转录酶，50水浴孵育 50min;70水浴15min终止反应后，将样品置于冰上冷却，然后加入 RNaseH并移至 37水浴孵育 20min. 1.2.2 巢式 PCR扩增 FLcDNA 外侧引物 1，5端引物:5-3cg gaa ttc gag act tgt tct tct gtc cc;3端引物:5-3cg gga tcc tca gtg ctc cac aag cag c;内侧引物 2，5端引物:5-3cg gga tcc aac ggc acc cag gac tgc tcc ttc;3端引物:5-3cgt aag ctt cta
12、tgt cgg ggc tgt ggc ctc.取 1L FLcDNA为模板，加入10PCR缓冲液 5L，25mmolL-1 MgCl2 5L.25mmolL-1 4dNTPs1L，25molL-1 外侧引物各 1L，用水补足体积至 50L，上覆石蜡油.95预变性 5min后，加 TaqDNA聚合酶，9460s，5560s，7260s.扩增 30个循环.取第 1轮 PCR扩增产物 1L 为模板，加入内侧引物进行第 2轮 PCR扩增（其他成分同上）.9460s，5560s，7260s.扩增 30个循环. 1.2.3 重组 pGEM-3zf（-）-FL 的构建 取纯化后经 EcoR，BamH双酶切
13、的 FL基因片段 60ng，纯化后经 EcoR，BamH双酶切的 pGEM-3zf（-）质粒 20ng，T4DNA 连接酶 1L，T4DNA 连接酶10缓冲液 1L，用水补足体积至 10L，16连接 12h，以 5L 连接产物转化 100L 大肠杆菌 JM109感受态细胞，挑取转化皿上生长的单菌落，扩大培养后提取质粒，用 EcoR，BamH限制酶进行酶切鉴定. 1.2.4 DNA序列分析 取重组质粒 35g 为模板，经 PE公司的310自动测序仪测序. 1.2.5 重组表达载体的构建 从重组的 pGEM-3zf（-）-FL 质粒上用EcoR和 Hind双酶切下目的片段.再用 EcoR和 Hin
14、d双酶切下pRSET-B载体.载体和目的片段均用 NucleoTrap Gel Extrac-tion试剂盒从琼脂糖凝胶内回收.然后进行 DNA连接，将 DNA连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，用氨苄青霉素（Amp）抗性进行筛选，经酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆. 1.2.6 蛋白的诱导表达与 Western-blot鉴定 挑取 pRSET-B-FL重组表达菌株，接种于 5mL含 Amp的 LB培养基，37培养过夜，次日按 5%转接于含 Amp的 LB培养基，37振荡培养 3h，加入 IPTG（异丙醇-D-硫代半乳糖苷）至终浓度 1mmolL-1 诱导表达，37振荡培养4h，取
15、菌体，做 120gL-1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）.Western-blot 鉴定参照文献11. 1.2.7 FL融合蛋白的纯化 将诱导表达的大肠杆菌离心收集菌体，加入裂解液（20mmolL-1 Tris-HCl，pH8.0，2.5mmolL-1 EDTA，10mmolL-1 MgCl2 ，1mgL-1 DNase） ，高压匀浆裂菌后，12000gmin-1 离心收集上清，将 250gL-1 硫酸铵在 2min内缓慢加入不停搅动的裂菌上清，4放置 1h后，12000gmin-1 离心收集上清，用pH8.0，20mmolL-1 Tris-HCl缓冲液 4透析 24h，中间换
16、 1次透析液，12000gmin-1 离心收集上清，将上清上到用缓冲液A（pH8.0，20mmolL-1 Tris-HCl）平衡过的 Q-Sepharose FF阴离子柱，上样后用缓冲液 B（pH8.0，20mmolL-1 Tris-HCl，1molL-1 NaCl）线形梯度洗脱，将穿过峰和洗脱峰收集后，经 SDS-PAGE分析显示，目的蛋白在第 2个洗脱峰.将收集到的第 2个洗脱峰的样品用 pH6.0，20mmolL-1 PBS缓冲液 4透析 24h，中间换 1次透析液，12000gmin-1 离心收集上清，将上清上到用缓冲液 A（pH8.0，20mmolL-1 Tris-HCl）平衡过的
17、SP-Sepharose FF阳离子柱，上样后用缓冲液 B线形梯度洗脱（pH6.0，20mmolL-1 PBS，1molL-1 NaCl） ，将穿过峰和洗脱峰收集后，SDS-PAGE 分析鉴定. 2 结果 2.1 RT巢式 PCR RT-巢式 PCR扩增后琼脂糖电泳的结果显示产物为 462bp的一条带，大小与预计相符（Fig1）. 图 1 略 2.2 重组质粒 pGEM3zf （）FL 的构建及鉴定 PCR获得的 FL基因片段经 EcoR和 BamH酶切，与经 EcoR和 BamH酶切的 pGEM-3zf（-）质粒连接，得到的重组质粒用 EcoR，BamH双酶切，得到462bp的目的基因片段（
18、Fig2） ，证明获得了 pGEM-3zf（-）-FL 重组体. 图 2 略 2.3 DNA序列分析 以 T7，SP6Promotor 引物从 pGEM-3zf（-）-FL模板的正反两方向进行测序，结果表明克隆的基因序列与文献12报道的人 FLcDNA序列一致（Fig3）. 图 3 略 2.4 重组质粒 pRSETBFL 的构建及鉴定 将经 EcoR和 Hind酶切 pGEM-3zf（-）-FL 所得的 FL基因片段与经 EcoR和 Hind酶切处理的 pRSET-B表达载体相连接，获得含有 FL的 pRSET-B表达载体的阳性克隆（Fig4）. 图 4 略 2.5 重组表达载体 pRSETB
19、FL 的诱导表达及 Westernblot 鉴定 将经 EcoR和 Hind酶切鉴定过的重组质粒 pRSET-B-FL转化大肠杆菌BL21（DE3） ，诱导表达后，取样处理，进行 120gL-1 SDS-PAGE，约在 Mr 24000处有一明显的新生带，与 FL融合蛋白预计的相对分子量相符，其表达量约占细菌蛋白质总量 20%，主要以可溶形式存在.以羊抗人的 FL mAb进行免疫印迹反应，约在 Mr 24000有明显的唯一反应带（Fig5） ，表明该融合蛋白具有 FL的抗原性. 图 5 略 2.6 FL融合蛋白的纯化 收集诱导菌液的菌体，经裂菌后，SDS-PAGE分析显示，目的蛋白在上清中.将
20、 FL融合蛋白的裂菌上清经250gL-1 硫酸铵沉淀后，经 SDS-PAGE分析，目的蛋白在上清中，将其用 pH8.0，20mmolL-1 Tris-HCl缓冲液透析 24h后上 Q-Sepharose FF阴离子柱，收集各个洗脱峰后，经 SDS-PAGE分析显示，目的蛋白在第 2个洗脱峰，并且除去了一部分杂蛋白.将收集到的第 2个洗脱峰的样品用 pH6.0，20mmolL-1 PBS透析 24h后上 SP-Sepharose FF阳离子柱，收集各个洗脱峰后，经 SDS-PAGE分析显示，目的蛋白在第 1个洗脱峰，蛋白纯度达到 90%（Fig6）. 图 6 略 3 讨论 克隆 FL基因多采用骨
21、髓、胎盘等造血组织13 ，人外周血单个核细胞中 FL也有较高表达14 ，并且来源广泛、操作简单，因此我们从人外周血单个核细胞中克隆 FL胞外段基因.正常生理条件下，FL 蛋白有膜结合型和可溶型两种形式，前者是由 N端信号肽、胞外区、跨膜区和胞质区组成的型跨膜蛋白，表达在细胞表面，可能通过作用于临近细胞上的特异性受体发挥作用;后者实际上是膜结合型蛋白的胞外区，它以可溶形式存在，保留了与特异受体识别和结合的能力，可以作用于远程细胞或组织上的受体.蛋白酶对膜结合蛋白的切割或 mRNA的不同拼接是可溶型 FL生成的机制15 .设计引物扩增 FL胞外区 cDNA，为其在原核中表达及功能研究提供了条件.由
22、于 FL mRNA在正常细胞和组织中的含量很低，为提高 PCR反应的效率及特异性，设计了内外两对引物，采用巢式 PCR的方法扩增目的基因.外引物扩增 FL跨膜蛋白的整个编码序列，长 981bp;内侧引物扩增编码第 27-182个氨基酸的 FL胞外区.实验中，我们发现，目的基因 3端的长短对其表达有影响，开始我们表达156个氨基酸的 FL蛋白，试过各种载体，均无表达，文献15报道表达有 153个氨基酸的 FL蛋白，于是我们重新设计了 3端引物，减少了两个氨基酸，结果用表达载体 pRSET-B表达了 FL.pRSET-B是一个受 PT7 强启动子驱动下的融合表达载体，因而易于在原核进行目的基因高表
23、达.另外，在目的基因的 5端融合了 6个组氨酸的纯化标签，可以用金属螯合亲和层析来分离纯化表达的融合蛋白.但是由于金属螯合亲和层析的方法不经济，无法用于大规模的生产，因此我们根据将来生产的要求，采用离子交换层析法对融合蛋白经行纯化.我们发现融合蛋白主要以可溶的形式存在，经过一系列不同浓度硫酸铵沉淀，融合蛋白在250gL-1 硫酸铵沉淀时，沉淀中没有融合蛋白，同时又近可能的将其他杂蛋白沉淀出.经过两次离子交换层析，获得了纯度达 90%的融合蛋白. 本研究成功地克隆到人 FLcDNA，构建了 FL的原核表达载体并在大肠杆菌中得到高效表达，对 FL融合蛋白进行了初步纯化，为下一步细胞、动物实验以及大规模生产奠定了基础. 参考文献: 1Broxmeyer HE，Lu L，Cooper S， Ruggieri L，Li ZH，Lyman SD.Flt3ligand stimulates/costimulates the growth of myeloid
