1、人肺腺癌细胞系 A549 细胞双向电泳 飞行时间质谱研究作者：杨拴盈，田应选，南岩东，卜丽娜，霍树芬，阮禹松 【摘要】 目的 初步分析人肺腺癌细胞系 A549 细胞蛋白质表达情况，从蛋白组水平探讨肺腺癌发病的分子机制。方法 应用 2DE 技术对人肺腺癌细胞系 A549 细胞总蛋白进行分离，获得蛋白质表达谱；应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOFMS) 结合生物信息学进行蛋白质鉴定。结果 3 块胶平均蛋白斑点数为 113849，平均匹配点数为98632，匹配率为 85.8%。随机选取背景清晰、分辨清楚、蛋白含量较高的 20 个斑点进行 MALDITOFMS 分析，共获得了 18
2、个肽质量指纹图谱(PMF)。将 PMFs 质量数据通过 Aldente 软件查询 SWISSPROT 数据库，根据匹配片段及氨基酸序列覆盖率等，初步鉴定出 15 种蛋白质。根据功能，这些蛋白质可分为：基本代谢相关的酶类：果糖 2 磷酸醛缩酶、视网醛脱氢酶 1(RALDH1)、吡多醛激酶；细胞骨架类：蛋白细胞角蛋白8(CK8)、2 链微管蛋白；应激相关蛋白：蛋白二硫化物异构酶A3(PDIA3)； 信号转导分子：膜联蛋白 1(ANX1)、膜联蛋白 4(ANX4)；分子伴侣：热休克蛋白 60(HSP60)、热休克蛋白 1 、抑制素(PHB)；转录及翻译相关蛋白：不均一性核糖核蛋白 H(hnRNP H
3、)；杂类：Rgr protein、NPM、PCBP1。结论 应用 2DE/MALDIMS 方法获得了较为理想的人肺腺癌细胞系 A549 细胞 2DE 蛋白质表达谱，初步鉴定了 15 种蛋白质。【关键词】 人肺腺癌细胞系；蛋白质组学；双向电泳；基质辅助激光解吸离子化电离飞行时间质谱；肽指纹图谱A proteomic study on human lung adenocarcinoma cell line A549 by 2DE and MALDITOFMSABSTRACT: Objective To analyze protein profiles in human lung adenocarc
4、inoma cell line A549 cell and to investigate molecular mechanism of pulmonary adenocarcinoma genesis at the level of proteomics. Methods Two dimensional gel electrophoresis (2DE) was used to separate totally soluble proteins extracted from A549 cell, and peptide mass fingerprintings (PMFs) were obta
5、ined and then some spots on 2DE gels were identified by matrixassisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS) combined with bioinformatics. Results The average total number of proteins spots was 113849, average paired spots 98632, and matched rate 85.8% among the thr
6、ee gels. 20 spots with high resolution and reproducibility were analyzed using MALDITOFMS, 18 spots yielded PMFs, and 15 proteins were preliminarily identified and further classified into 7 categories based on their functions: enzymes related to cell metabolism: fructosebisphosphate aldolase A, reti
7、nal dehydrogenase 1(RALDH1), pyridoxal kinase; cytoskeleton proteins: type II cytoskeletal 8(CK8), tubulin beta2 chain; proteins related to stress: protein disulfideisomerase A3 (PDIA3); signal tranduction molecules: annexin A1(ANX1)and annexin A4(ANX2); chaperones: 60ku heat shock protein(HSP60), h
8、eat shock protein beta1, prohibitin(PHB); proteins related to transcription and translation: heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H(hnRNP H); others: Rgr protein, nucleophosmin(NPM), poly(rC)binding protein 1(PCBP1). Conclusion A clear, wellresolved protein profile in A549 cell was obtained by 2D
9、E and 15 proteins were identified using PMFs.KEY WORDS: human lung adenocarcinoma cell line; proteomics; two dimensional gel electrophoresis; matrixassisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS); peptide mass fingerprinting肺癌是目前全球范围内发病率最高的恶性肿瘤1，腺癌是肺癌中最主要的组织学类型之一。由于肺
10、腺癌发病机制不明、转移早、对放疗及化疗不敏感，因此，已成为制约肺癌 5 年生存率的主要因素。近年来，由于蛋白质组学(proteomics)技术具有高通量、高重复性及高灵敏性等特点，能够从整体水平(蛋白)分析蛋白质的变化，故其已成为探讨肿瘤发病机制和筛选其早期诊断标志物的强有力工具23 。在本研究中，我们应用双向电泳(two dimensional gel electrophoresis, 2DE) 和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry, MALDIT
11、OF MS)技术结合生物信息学方法，检测人肺腺癌细胞系 A549细胞蛋白质的表达情况，旨在从蛋白水平探讨腺癌的发病机制。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞 人肺腺癌细胞系 A549 细胞引自西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所，用含 10%(体积分数)小牛血清的RPMI1640 培养液进行传代培养。1.1.2 主要仪器 UP 200s 超声破碎仪 (Dr.Hielscher GmbH)；Ultrospec 2100proUV/Visible Spectrometer (Amersham Bioscience)；IPGphor 等电聚焦仪(Amersham Biosciences 公
12、司)；Hoefor SE600 垂直电泳仪(Amersham Biosciences)；ScanMaker 8700 扫描仪(MICROTEC)；Model 250 pH 计(Thermo Orion)；WR2001 型溶剂过滤器(上海嘉鹏科技有限公司)；Milli Q 超纯水发生器(Millipore)；VoyagerDETM MALDITOF 质谱仪(Applied Biosystems)；CentriVap Concentrator(Labconco 公司)；凝胶图像分析软件ImageMaster(Amersham Biosciences 公司)；超速低温离心机(德国Sigma 公司)；
13、冷冻真空干燥机(美国 Heto 公司)。CO2 细胞培养箱(REVCOELITE2) ，倒置相差显微镜(NIKon/TMS)。1.1.3 试剂 尿素(Urea)、硫脲(thiourea)、三羟基甲基氨基甲烷碱(Trisbase) 、EDTA、Protease Inhibitor Mix、CHAPS、TX100 、十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)均购自Promega 公司；溴酚蓝、甘氨酸、过硫酸铵均购自美国 AMRESCO；丙烯酰胺(Arc)、甲叉双丙烯酰胺、碘乙酰胺(iodoacetamide)、硝酸银、蛋白质组学级(proteomics grade)TPCK 胰蛋白酶(TPCK
14、trypsin) 、胰蛋白酶、三氟乙酸(TFA)、基质 氰基4 羟基肉桂酸(CHCA)均购自 Sigma公司；低熔点琼脂糖、甲醇、冰乙酸、固相 pH 梯度干胶条(IPG strip, 13cm, pH3-10)、IPG 缓冲液(pH3-10)均购自 Amersham PharmaciaBiotech 公司；低分子量标准蛋白质购自上海伯奥生物制品公司；甘油、碳酸氢铵等其余试剂均为国产分析纯；新生小牛血清购自杭州四季青有限公司，RPMI1640 培养基购自 GIBCO 公司。所有溶液均用Milli Q 水配制。1.2 方法1.2.1 细胞总蛋白的提取 用含 10%(体积分数)小牛血清的RPMI16
15、40 培养基进行传代培养 A549 细胞。待细胞生长至对数生长期时，胰酶消化，室温 1000r/min 离心 10min，弃上清，重复 3 次；将 1107个细胞重悬于 100L 预冷裂解缓冲液(8mol/L urea， 40g/L CHAPS，40mmol/L Trisbase ，65mmol/L DTT，0.5% Pharmalyte pH3-10，1mmol/L PMSF)中，在 4静置 30min；冰浴中超声破碎 10s(每次5s，间隔 5s)；4 15000r/min 离心 20min，取上清；Bradford 法蛋白定量，分装，-80冻存备用。1.2.2 2DE 用 13cm 固定
16、胶条(pH3-10)，上样量 45g。参照IPGphor 等电聚焦系统指南进行。最大电流 60A/IPGstrip；水化和聚焦在 20自动进行。总电压时间积 30000Vh，最后在 8000V 下进行等电聚焦。将胶条进行两步平衡后，移至 12.5%分离胶的上端，进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE) 。电泳完成后，按蛋白质银染试剂盒的操作手册进行银染。1.2.3 凝胶图像分析 图像扫描后，在 ImageMaster 2D Elite 4.01 分析软件辅助下，进行背景消减、点检测、匹配、获取斑点位置坐标等分析。1.2.4 质谱分析 对银染蛋白点进行胶内酶切，脱色，还原，烷基化，
17、酶解(用 TPCK 胰蛋白酶)、萃取及冻干，将制备好的样品置于VoyagerDE MALDITOF 质谱仪上进行分析。采用线性模式、正离子谱测定，离子源加速电压为 20kV，离子延迟提取 500ns，质谱信号单次扫描累加 50 次，以多肽质量标准(ABI 公司)为外标。1.2.5 肽质量指纹图谱的数据库查询 将结果通过 Aldente 软件进行肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprintings, PMF)查询。数据库选择 SWISSPROT ，PMF 中的肽片段质量控制在 1000-5000，肽片段分子质量最大容许误差(Peptide tol.)控制在0.5u，Enzym
18、e 选择胰酶，酶解片段不完全(missed cleavages)选择为 1 个，物种来源(taxonomy)选择人类，离子选择M+H+和平均(average)，固定修饰(fixed modifications)选择脲甲基半胱氨酸(carbamidomethylCys) 。2 结果2.1 人肺腺癌细胞系 A549 细胞总蛋白的 2DE 图谱 图 1 为A549 细胞总蛋白的银染 2DE 图谱。在相同条件下，对 A549 细胞总蛋白进行了 3 次 2DE 检测。经图像扫描后，应用 ImageMaster 2D Elite 4.01 分析软件对图像进行分析，结果显示 3 块胶的平均蛋白斑点数为113
19、849，用其中 1 块胶作为参考胶进行匹配，平均匹配点数为98632，匹配率为 85.8%。图 1 人肺腺癌细胞系 A549 细胞总蛋白双向电泳图谱（略）Fig.1 2DE gels of total protein extracts from human lung adenocarcinoma cell line A5492.2 蛋白质斑点的 MALDITOFMS 分析 从 3 块胶上匹配的蛋白点中随机选取背景清晰、分辨清楚、蛋白含量较高、重复性较好的 20个斑点进行质谱分析。共获得了 18 张 PMF。图 2 是 1 号蛋白质点的PMF。2.3 数据库查询鉴定蛋白质 对 20 个蛋白点进行
20、MALDITOFMS 分析。结果显示，大多数 PMF 图背景很低，峰信号较强，以 1000-5000 之间的片段峰较多。将 PMFs 质量数据通过 Aldente 软件查询 SWISSPROT 数据库，根据匹配片段及氨基酸序列覆盖率，结合表观Mr 及 pI，初步鉴定出 15 种蛋白质(表 1)。2 个点未获得 PMF，2 个 PMF未搜索到匹配的蛋白质。初步鉴定的 15 种蛋白质根据功能可分为：基本代谢相关的酶类fructosebisphosphate aldolase A(果糖 2 磷酸醛缩酶)，retinal dehydrogenase 1(RALDH1，视网醛脱氢酶 1)，pyridox
21、al kinase(吡多醛激酶)；细胞骨架类蛋白type II cytoskeletal 8(CK8，细胞角蛋白 8)，tubulin beta2 chain(2链微管蛋白)；应激相关蛋白protein disulfideisomerase A3 (PDIA3，蛋白二硫化物异构酶 A3)；信号转导分子annexin A1(ANX1，膜联蛋白 1)，annexin A4(ANX2，膜联蛋白 2)；分子伴侣60ku heat shock protein(HSP60，热休克蛋白 60)，heat shock protein beta1( 热休克蛋白 1) ，prohibitin(PHB，抑制素)；转
22、录及翻译相关蛋白heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H(hnRNP H，不均一性核糖核蛋白 H)；杂类Rgr protein，nucleophosmin(NPM)，poly(rC)binding protein 1(PCBP1)。图 2 人肺腺癌细胞系 A549 细胞双向电泳图谱中 1 号蛋白质点的肽质量指纹图谱（略）Fig.2 Peptide mass fingerprinting of protein spot No. 1 in 2DE profile from human lung adenocarcinoma cell line A549 c
23、ell表 1 人腺癌细胞系 A549 细胞双向电泳凝胶部分蛋白质点鉴定结果（略）Table 1 List of identified protein spots in 2DE gel from human lung adenocarcinoma cell line A 549 cell3 讨论蛋白质组学技术已成为当前探讨肿瘤发病机制的最有效的策略之一。由于样品制备相对容易及在膜蛋白、信号转导通路及分泌蛋白等的研究中具有较大的优势，故肿瘤细胞系是肿瘤蛋白质组学研究的良好模型45 。A549 细胞是从肺癌患者癌组织中分离出来的非小细胞肺癌细胞系，与患者体内的癌细胞具有基本相似的生物学特性。为了在蛋
24、白质组水平探讨肺腺癌发生的分子机制，本文应用 2DE/MALDITOFMS 方法对人肺腺癌细胞系 A549 细胞进行了表达蛋白质组学研究。经 2DE 分离、图像扫描及分析后，发现 3 块胶的平均蛋白斑点数为 113849，用其中1 块胶作为参考胶进行匹配，平均匹配点数为 98632，匹配率为85.8%。提示我们获得了重复性较好的 A549 细胞的 2DE 图谱。从 3 块胶上匹配的蛋白点中随机选取背景清晰、边界清楚、蛋白含量较高的 20个斑点进行质谱分析，初步鉴定了 15 种蛋白质。根据功能，这些蛋白质可分为基本代谢相关的酶类、细胞骨架蛋白、应激相关蛋白、分子伴侣、信号转导分子、转录及翻译相关
25、蛋白及其他等。果糖 2 磷酸醛缩酶 A 为糖酵解相关的酶类。Li 等6应用2DEMS 研究了 20 例人肺鳞癌及其配对的正常肺组织后发现，包括果糖 2 磷酸醛缩酶 A 在内的 6 种蛋白质在癌组织中表达上调，提示这些蛋白可能对肺鳞癌早期诊断和靶向治疗具有重要意义。RALDH 是与维甲酸(retinoic acid, RA)合成有关的关键酶。研究表明，氮能通过抑制RALDH 而干扰维甲酸信号通路，导致先天性膈疝和肺发育不良7。细胞骨架(cytoskeleton)具有决定和维持细胞形态、对细胞器和细胞浆中的蛋白质进行空间组织及参与细胞运动、分裂、胞浆运输等功能，是抗癌药物作用靶点之一。CK8 是细
26、胞骨架的重要成分，是上皮细胞与肿瘤细胞相关的 21 种中间丝家族表达最广泛的成员。在 Fas 受体介导的信号途径中，CK8 是 JNK(cjun Nterminal kinase)的胞内靶点。已知紫杉醇的抗癌作用主要与其可和 链微管蛋白结合有关。应用反义寡核苷酸技术，Tommasi 等发现抑制 链微管蛋白可部分提高紫杉醇的化疗敏感性。Mozzetti 等8发现，在耐药的卵巢癌细胞中， 链微管蛋白表达明显上调，推测该蛋白过表达可能是泰索帝三种耐药机制中最重要的一种。PDI 为应激相关蛋白，可催化蛋白质肽链内及肽链间二硫键的连接及蛋白折叠，调节转录因子的活性，参与糖蛋白的组装等。Bianchi 等9认为，PDI 通过细胞应激和蛋白折叠而参与肿瘤形成。Ryu 等对人胃癌组织及其配对的正常胃组织、癌旁组织进行了蛋白质组学研究，结果显示，包括 PDIA3 在内的 7 种蛋白在癌组织中表达上调，提示癌细胞具有自我保护机制。为了寻找胃癌早期诊断标志蛋白，Ren 等10应用SELDITOFMS 技术检测了胃癌患者及正常人的血清，筛选出了一个包括 PDIA3 在内的四种蛋白质组成的标志物组合模式。分子伴侣能抑制细胞内蛋白降解，帮助蛋白正确折叠，能调节蛋白分泌、细胞运动、基因表达，还参与细胞周期、细胞凋亡和分化等的调
