1、人类错配修复基因 hMLH1 和 hMSH2 错义突变真核表达载体的构建及表达【摘要】 目的 构建人类错配修复基因 hMLH1 和 hMSH2 错义突变真核表达载体并检测它们在瞬时转染细胞中的蛋白表达。方法 重组pcDNA3.1-hMLH1-wt 和 pcDNA3.1-hMSH2-wt 质粒为模板，用定点诱变的方法分别构建 hMLH1 基因和 hMSH2 基因错义突变真核表达载体，将诱变前后的重组质粒瞬时转染至 HCT-116 细胞(hMLH1 基因缺陷型)或 LoVo 细胞(hMSH2 基因缺陷型)中，免疫印迹法和免疫荧光法分别检测这两种基因在各自的转染细胞中的蛋白表达。结果 测序证实，定点
2、突变成功，构建出hMLH1 基因错义突变 pcDNA3.1-hMLH1-T117M 和 pcDNA3.1-hMLH1-V384D 真核表达载体以及 hMSH2 基因错义突变 pcDNA3.1-hMSH2-L390F、pcDNA3.1-hMSH2-Q419K 和 pcDNA3.1-hMSH2-Q629R 真核表达载体。结果表明转染后，除 hMLH1-T117M 突变体蛋白表达缺失外，其余的野生型及突变型真核表达载体在转染细胞中均能表达相应的蛋白。结论 成功构建了在人的肿瘤细胞系中能有效表达的两种 hMLH1 基因错义突变和三种 hMSH2 基因错义突变的真核表达载体，为进一步研究这些错义突变的病
3、因学作用和功能意义奠定了实验基础。 【关键词】 hMLH1;hMSH2;错义突变;定点突变;真核表达载体;转染;蛋白表达遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)，又称 Lynch 综合征，是一种由错配修复基因(mismatch repair gene，MMR)发生胚系突变造成的常染色体显性遗传性肿瘤，约占结直肠癌总数的 5%15%1-2。HNPCC的发病与人类错配修复基因功能异常密切相关，hMLH1 和 hMSH2 基因突变在 HNPCC 病人总突变中占 90%以上，是导致 HNPCC 发病的主要原因3。在临床诊断上尽管阿姆斯特丹标准对 HNPCC 的发病特点做了较为明确的描述4，但由于 HNPC
4、C 患者缺乏明显的临床指征，误诊率高，因此HNPCC 的确诊还有赖于错配修复基因胚系病理性突变的检出。在 hMLH1和 hMSH2 基因突变谱中，大约三分之一的突变属于错义突变5-6。相对于大多数导致截短蛋白的恶性突变，这种单个氨基酸改变的错义突变对蛋白功能的影响往往差异较大，因此对这些错义突变进行功能评估，明确其属于无害突变还是病理性突变，其基因功能是部分受到影响还是完全表达失活，在分子病理学诊断上具有重要意义。鉴于此，本文选择在华人中疑似 HNPCC 家系中发现的五种错义突变，即 hMLH1 基因的 T117M和 V384D 以及 hMSH2 基因的 L390F、Q419K 和 Q629R
5、，采用定点突变技术构建其真核表达载体，并用免疫印迹法和免疫荧光法对转染细胞进行蛋白表达分析，为进一步研究这些错义突变的病因学作用和功能意义，评估其可能的临床意义奠定实验基础。1 材料和方法1.1 材料人结肠癌 LoVo 细胞株和 HCT-116 细胞株均购自美国ATCC(American type culture collection)。重组质粒 pcDNA3.1-hMLH1-wt 和 pcDNA3.1-hMSH2-wt 由德国法兰克福 JW Goethe 大学附属医院Stefan Zeuzem 博士惠赠。质粒 pcDNA3.1+(V790.20)购自美国Invitrogen 公司。定点突变试
6、剂盒 QuikChange Site-directed Mutagenesis kit 购自美国 Stratagene 公司，质粒提取试剂盒 QIAGEN Miniprep Kit 购自德国 QIAGEN 公司。Fugene 6 转染试剂购自美国Roche 公司。免疫印迹分析所用一抗 hMLH1 单克隆抗体(Clone：G168-728)和hMSH2 单克隆抗体(Clone：27)均购自美国 BD Biosciences 公司。-actin 抗体(CLONE AC-15)购自美国 Sigma 公司。二抗辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠 IgG，增强型 ECL 试剂盒和硝酸纤维素膜均购自美国
7、Amersham Biosciences 公司。用于免疫荧光分析的二抗 Alexa Fluor 488 Gt A-Mo IgG(H+L)购自美国 Invitrogen 公司。荧光倒置显微镜为日本的 Nikon ECLIPSE TE2000-S。用 ABI 3130 DNA 测序仪(美国应用生物系统公司)进行测序。1.2 细胞系及培养LoVo 细胞用 RPMI-1640 培养基，HCT-116 细胞用 McCoys 5A 培养基。培养基含 10%胎牛血清、100umL-1 青霉素和 100umL-1 链霉素。在 37、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。1.3 表达载体的构建及定点突变重组 pc
8、DNA3.1-hMLH1-wt 和 pcDNA3.1-hMSH2-wt 质粒为模板，根据公布的 hMLH1 基因序列(NM_000249.2)和 hMSH2 基因序列(NM_000251.1)以及定点诱变的要求分别设计合成了含有预期突变位点的五对定点突变引物，突变引物序列如下：hMLH1-T117M 正向引物为 5-GGCTCATGTTACTATTACAATGAAAACAGCTGATGGAAAGTG-3，反向引物为 5-CACTTTCCATCAGCTGTTTTCATTGTAATAGTAACATGAGCC-3;hMLH1-V384D 的正向引物为 5-TATGCCCACCAGATGGATCGTA
9、CAGATTCCCG-3，反向引物为 5-CGGGAATCTGTACGATCCATCTGGTGGGCATA-3;hMSH2-L390F 正向引物为 5-TCCCAGATCTTAACCGATTTGCCAAGAAGTTTCAAAGAC-3，反向引物为 5-GTCTTTGAAACTTCTTGGCAAATCGGTTAAGATCTGGGA-3;hMSH2-Q419K 正向引物为 5-ATAAATCAACTACCTAATGTTATAAAGGCTCTGGAAAAACATGAAGG-3，反向引物为 5-CCTTCATGTTTTTCCAGAGCCTTTATAACATTAGGTAGTTGATTTAT-3以及 hM
10、SH2-Q629R 正向引物为 5-CAGCCATTTTGGAGAAAGGACGAGGAAGAATTATATTAAAAGCATC-3，反向引物为 5-GATGCTTTTAATATAATTCTTCCTCGTCCTTTCTCCAAAATGGCTG-3。其中下划线为预期突变的密码子，粗体为引入突变的核苷酸，按照 Stratagene 公司的 QuikChange Site-directed Mutagenesis kit 试剂盒使用说明进行定点突变反应。50L 的含pfuTurboDNA 多聚酶的热循环反应体系在 95 变性 30s 后，95 变性30s，55 退火 1min，68 延伸 8min，
11、经过 12 个扩增循环后，用限制性内切酶 Dpn I 特异性切除甲基化的模板 DNA。将带缺口的突变质粒转化到 E.coli.XL1-Blue 感受态细胞中，用 Amp 抗性 LB 平板筛选阳性克隆，用 QIAprep Spin Miniprep Kit 试剂盒进行质粒提取，用 ABI 3130 DNA测序仪进行测序以验证是否正确引入预期突变并冻存剩余菌液。1.4 转染以 hMLH1 基因野生型及两种错义突变的真核表达载体分别转染HCT-116 细胞，以 hMSH2 基因野生型及三种错义突变的真核表达载体分别转染 LoVo 细胞。在转染前 1d，用无血清培养基以 1-3105mL-1 细胞密度
12、接种于 6 孔培养板，每孔 2mL，于 37 ，5% CO2 培养箱培养 24h，待细胞汇合度达 60%80%时，按每孔 2g 的质粒 DNA 与 6L 的 Fugene 6 转染试剂即 32 的比例转染细胞。空转染对照组不含质粒 DNA，阳性对照组为重组的野生型质粒，阴性对照为 pcDNA3.1+质粒。培养 6h 后，更换含有血清的全培养基继续培养以进行后续的免疫印迹分析和免疫荧光分析。1.5 免疫印迹(Western blot)收获转染 48h 后的各组细胞，按下述方法分别提取细胞核蛋白并进行 SDS-PAGE 胶蛋白电泳，免疫印迹法检测这些蛋白在瞬时转染细胞中的表达，-actin 抗体为
13、内参对照。细胞裂解液的制备：收集培养的细胞，以预冷的 PBS 漂洗 2 次，以 1000 rmin-1 离心 5min，弃上清，分别用裂解缓冲液 A(10 mM HEPES，pH 7.9;10 mM KCl;1.5 mM MgCl2;1 mM DTT 和 1 mM PMSF)冰浴15min 裂解细胞，4下 12000 rmin-1 离心 20s，弃上清。用含有 1 倍蛋白酶抑制剂混合物的裂解液 B(20 mM HEPES，pH 7.9;420 mM NaCl;1.5 mM MgCl2;0.2 mM EDTA;20% Glycerol;1 mM DTT 和 1 mM PMSF)重新悬浮核沉淀物，
14、4孵育 30min 后，12000 rmin-1 离心 5min，取上清。取 30g 的等量蛋白用 8%十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行分离，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜。一抗为鼠源的 hMLH1 单克隆抗体以及鼠源的 hMSH2 单克隆抗体，1250 稀释，-actin 抗体为内参对照，室温孵育 1h，PBST 洗膜。二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠 IgG，110 000 稀释，室温孵育 1h，PBST 洗膜。增强型 ECL 试剂盒显色，暗室曝光显影。1.6 免疫荧光分析当细胞在盖玻片上爬片生长至大约 60%融合度时进行细胞转染，48h 后收获
15、细胞。PBS 洗 2 遍，用 100%预冷的丙酮在-20固定过夜。PBS洗 3 遍，用 0.5%的 Triton X-100/PBS 室温处理 10min 以增加细胞的渗透性。PBS 洗 3 遍，用封闭缓冲液(PBS;1%BSA;0.2%Tween 20;5mM Tris/HCl，pH7.6)室温封闭 1h。PBS 洗后，分别结合一抗和二抗。一抗为鼠源的 hMLH1 单克隆抗体以及 hMSH2 单克隆抗体，使用浓度为 1250;二抗为 Alexa Fluor 488 标记的羊抗鼠 IgG(H+L)，使用浓度为 1400，室温下避光孵育 1h 后封片，用荧光倒置显微镜进行观察拍照。2 结果2.1
16、 表达载体的构建及定点突变hMLH1 基因位于人类染色体 3p21.3，其基因组全长 58.14kb，有19 个外显子组成，包含 2 268bp 的开放阅读框，编码含 756 个氨基酸残基组成的蛋白。突变位点 T117M 和 V384D 分别位于外显子 4 和外显子 12上。hMSH2 基因位于人类染色体 2p21-22，其基因组全长 73kb，含 16 个外显子。其 cDNA 全长 3 111bp，含有 2 727bp 的开放阅读框，编码 909个氨基酸组成的蛋白质。突变位点 L390F、Q419K 以及 Q629R 分别位于外显子 5、外显子 7 和外显子 12 上。构建了含预期突变位点的
17、错义突变表达载体。DNA 测序证实(图1、2，见封 3)，hMLH1 基因中 117 位点的苏氨酸(ACG)点突变成甲硫氨酸或起始密码子(ATG);384 位点的缬氨酸(GTT)点突变成天门冬氨酸(GAT)。同样，hMSH2 基因中 390 位点的亮氨酸(CTT)突变成苯丙氨酸(TTT);419 位点的谷氨酰胺(CAG)突变成赖氨酸(AAG)以及 629 位点的谷氨酰胺(CAA)突变成精氨酸(CGA)。序列分析表明，除特定碱基位点被突变的碱基替换外，其它序列和野生型序列完全保持一致。因此成功构建了 hMLH1 基因错义突变 pcDNA3.1-hMLH1-T117M 和 pcDNA3.1-hML
18、H1-V384D 真核表达载体以及 hMSH2 基因错义突变 pcDNA3.1-hMSH2-L390F、pcDNA3.1-hMSH2-Q419K 和 pcDNA3.1-hMSH2-Q629R 真核表达载体。2.2 Western 免疫印迹法检测结果Western 免疫印迹分析结果(图 3、4)表明，除转染的表达质粒为 A：pcDNA3.1-hMLH1-wt 野生型阳性对照;B：pcDNA3.1 质粒阴性对照;C：pcDNA3.1-hMLH1-T117M 突变体;以及 D：pcDNA3.1-hMLH1-V384D 突变体。-actin 为内源对照。图 3 构建的 hMLH1 真核表达载体转染 H
19、CT-116细胞 48h 后的蛋白免疫印迹结果hMLH1-T117M 突变体蛋白表达缺失外，其余的野生型及突变型的转染质粒在细胞中均有表达。蛋白大小与预期相符，野生型的蛋白表达量略高于它们相应的突变体。2.3 免疫荧光检测结果免疫荧光检测结果和 Western 检测结果基本相符(图 5，见封 3)。3 讨论hMLH1 和 hMSH2 基因突变是遗传性非息肉性结直肠癌发病的直接原因，其中错义突变约占已检突变的三分之一。因此建立有效的错义突变功能评估体系，确定检出突变的病因学作用具有重要意义。hMLH1 基因错义突变 T117M 是我们在一个早年患大肠癌的华人先证者中发现的，家族中有 3 名直系亲
20、属病理证实患 Lynch 氏症相关之癌症，具有明显的家族史和微卫星不稳定性，因此推测它是一个恶性突变7。该突变位点位于 hMLH1 基因的一段能与 hPMS2 相互作用的高度保守区，蛋白功能研究表明 hMLH1-T117M 突变体不能与 hPMS2 互动，丧失其错配修复功能8。在我们的实验中，免疫印迹法没有检测到 T117M 突变体蛋白的表达，免疫荧光法也只检测到微弱的表达。hMLH1 基因 V384D 突变在大肠癌患者和健康人群中均有发现，其病因学作用不清，可能是仅限于东亚人群中与 HNPCC 相关的非功能多态性9。hMSH2 基因 L390F、Q419K 和 Q629R 突变是在华人中发现
21、的错义突变。在 hMSH2 基因突变检测中，Q419K 和 Q629R 突变仅在华人大肠癌患者中发现，而在健康人群中未能检出。携带这 3 种错义突变的患者其家族成员至少有 2 位患 Lynch 氏症相关之癌症10，其病因学作用目前尚不清楚。错配修复基因突变会引起修复功能缺陷，从而产生遗传不稳定性，导致肿瘤和癌症的易患。这些错义突变的病因学作用和功能意义的阐明对我们加深理解 HNPCC 的发病机制，更好地为 HNPCC 高危家系提供基因诊断和遗传咨询，具有重要的临床指导意义和应用价值。毫无疑问，病因学作用和功能意义的阐明最终要得到肿瘤遗传流行病学研究结果和蛋白质功能实验证据的支持。本实验 hML
22、H1 和 hMSH2 基因错义突变真核表达载体的成功构建，为下一步研究突变基因的功能，评估其可能的临床意义奠定了实验基础。【参考文献】1 顾国利，周晓武，王石林.遗传性非息肉病性大肠癌的研究进展J.世界华人消化杂志，2007，15(29)：3115-3121.2 Hemminki K，Li X.Familial colorectal adenocarcinoma and hereditary nonpolyposis colorectal cancer：a nationwide epidemiological study from SwedenJ.Br J Cancer，2001，84：969
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