1、人野生型 p53 肿瘤抑制基因在烟草中的遗传转化【摘要】 目的： 构建人野生型 p53 肿瘤抑制基因的植物表达载体，并建立 p53 转基因烟草植株. 方法： 将人野生型 p53 肿瘤抑制基因编码区克隆于 pUC19, pBI426 和 pCAMBIA2301 载体，构建含人野生型 p53基因的植物表达载体 pCAMBIA2301/p53，p53 基因由 2CaMV 35S 启动子控制表达. 利用叶盘共培养法经根瘤农杆菌 EHA105 介导转化烟草，获得转基因烟草植株；用组织化学法,PCR、Southern 杂交检测转基因烟草植株. 结果： 经组织化学法,PCR, Southern 杂交检测表明
2、人野生型 p53 基因已整合到转基因烟草植株的基因组中，并获得了的转 p53 基因烟草植株. 结论： 成功建立了含人野生型 p53 基因的转基因烟草植株，为进一步检测 p53 基因的生物活性和开辟生产药用蛋白的新途径奠定了基础. 【关键词】 人野生型 p53 基因；转基因烟草；根瘤农杆菌；基因转化；抗菌药 【Abstract】AIM: To construct the plant transformation vector containing human wildtype p53 tumor suppressor gene and establish human wildtype p53 t
3、ransgenic tobacco plants. METHODS: The human wildtype p53 coding sequence was subcloned into vectors pUC19, pBI426 and pCAMBIA2301 to obtain plant expression vector pCAMBIA2301/p53. TDNA regions of the pCAMBIA2301/p53 binary vector contained constitutive 2Cauliflower mosaic virus (2CaMV) 35S promote
4、r, nopaline synthase terminator, and neomycin phosphotransferase (npt )gene, which allowed the selection of transformed plants against kanamycin. The tobacco (Nicotiana tobacum L.Cuttivar Xanthi) plants were transformed by cocultivating leaf discs method via Agrobacterium tumefaciens EHA105 harborin
5、g the plant expression vector. The generated transgenic tobacco plants were selected by kanamycin, and identified by histochemical assay, PCR, Southern blot. RESULTS: Histochemical assay, PCR and Southern blot analyses demonstrated the stable integration of the human wildtype p53 gene into the tobac
6、co genome.Transgenic tobacco plant with p53 gene was obtained successfully. CONCLUSION: Transgenic wildtype p53 tobacco plants have been established, which can serve as a base for further studies on detecting the biological activities of p53 gene and exploiting the new way of producing pharmaceutica
7、l proteins. 【Keywords】 human wildtype p53 gene; transgenic tobacco; Agrobacterium tumefaciens; gene transformation; antibacterial agents 0 引言 人类癌症中最常见的基因改变是 p53 基因突变，它是癌基因研究中重要的肿瘤抑制基因之一，野生型 p53 基因与细胞周期的生长调节、细胞转化的调节、DNA 复制以及诱导细胞程序性死亡有着密切关系1-2. 本研究利用转基因植物作为生物反应器的优点，将人野生型 p53 肿瘤抑制基因构建于植物表达载体，通过根瘤农杆菌介导的
8、转化方法将其转入烟草，获得表达人野生型 p53 基因的转基因植株，为今后借助转基因烟草或其它转基因植物作为生物反应器生产人野生型 p53 蛋白奠定了基础. 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 质粒、菌株人野生型 p53 肿瘤抑制基因由赵永同博士惠赠，植物表达载体 pCAMBIA2301，根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105，大肠杆菌（Ecoli.）DH5，pUC19 为本实验室保存. 1.1.2 主要试剂各种限制性酶、Tag 聚合酶、质粒快速提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒等购自 TaKaRa 公司和上海生工生物工程技术服务有限公司；高效地高辛 D
9、NA 标记检测试剂盒购自 Roche Molecular Biochemicals 公司. 头孢曲松钠购自上海先锋药业公司；卡那霉素购自华美生物工程公司，其他常规试剂均为国产分析纯试剂. 1.1.3 培养基 LB 及 MS 培养基按参考文献方法配制3. 浸染培养基：MS0+ AS（400mol/L ）+ pluronic F68 (0.5 mg/L)，AS 和pluronic F68 在浸染前加入. 共培养基：MS+BA(1 mg/L)+NAA(0.1 mg/L) + AS (400 mol/L)+pluronic F68 (0.5 mg/L). 选择培养基：MS+BA (1 mg/L)+ N
10、AA (0.1 mg/L )+Kanamycin (100 mg/L)+头孢曲松钠. 头孢曲松钠浓度依次为 50 mg/L, 100 mg/L, 150 mg/L, 200 mg/L, 300 mg/L, 400 mg/L, 500 mg/L, 600 mg/L. GUS 显色液按参考文献方法配制4. 1.1.4 植物材料烟草（Nicotiana tobacum L.Cuttivar Xianthi）为本实验室保存的无菌苗. 1.2 方法 1.2.1 人野生型 p53 肿瘤抑制基因植物表达 载体的构建人野生型 p53 肿瘤抑制基因两端酶切位点为 BamH和Not，经 BamH和 Not双酶切后
11、连接于载体 pUC19 中，得到重组载体pUC19/p53；分别将 pUC19/p53 和 pBI426 的质粒用 BamH和 Sst双酶切，经 T4 DNA ligase 连接，得到中间载体 pBI426/pUC19/p53，用Hind和 EcoR双酶切，回收目的片段，连接到 pCAMBIA2301 载体中，得到植物表达载体 pCAMBIA2301/p53，提取质粒，酶切鉴定，测序证实，通过冻融法4转化到根瘤农杆菌( Agrobacterium tumefaciens ) EHA105 中. 1.2.2 根瘤农杆菌的培养 挑取含 pCAMBIA2301/p53 质粒的根瘤农杆菌单菌落，接种于
12、 10 mL附加 200 mg/L 利福霉素和 100 mg/L 卡那霉素的液体 LB 培养基中（pH 7.0） ，28，180 r/min 恒温振荡培养过夜. 当培养至菌液 A600 约为0.6 时收集菌液，5000 r/min 离心 5 min，沉淀重悬于 2 倍体积的浸染培养液中以供转化用. 1.2.3 烟草的遗传转化 参照 Horsch 等5方法，采用叶盘共培养法进行烟草的遗传转化. 从烟草无菌苗上选取幼嫩叶片，切成 0.5 cm0.5 cm 小片，在农杆菌浸染液中浸泡 5 min，用无菌滤纸吸干多余菌液，将叶片表面向下置于共培养基上，在 28暗培养条件下共培养 34 d. 同时设空根
13、瘤农杆菌EHA105 浸染对照及未浸染对照. 将上述共培养叶片转移至选择培养基上，在每日光照 16 h,光照强度4000lx, 28条件下进行培养，诱导抗性愈伤组织的形成. 当愈伤组织长出新生芽至 1 cm 时，切下小芽转入新的选择培养基诱导分化. 每 18 d 左右更换一次选择培养基，待根系形成，幼芽长至 810 cm 后炼苗，移入温室种植. 1.2.4 转基因烟草的 GUS 活性检测 取转基因烟草叶片少许，放入平皿中，加入 GUS 显色液，使叶片完全淹没在溶液中，37保温 2 h 后观察. 1.2.5 转基因烟草的 PCR 检测 参照 CTAB 方法，分别提取转化植株和未转化植株叶片基因组
14、 DNA，进行 PCR 扩增，根据 wtp53 基因设计上下游引物，P1: 5CCAAGCAATGGATGATTTGATG3 ，P2: 5GAGTTTTTTATGGCGGGAGGTA3 （引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成） ，扩增条件为：95变性 5 min，94 30 s, 55 30 s, 72 90 s，35 个循环，72延伸 10 min. PCR 反应产物用 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测. 1.2.6 转基因烟草的 Southern blot 检测 提取 PCR 检测阳性植株的叶片基因组 DNA，用 Hind酶切，地高辛随机引物标记探针并进行 Southern 杂交检测
15、，方法按照 Roche 试剂盒说明进行. 2 结果 2.1pCAMBIA2301/p53 植物表达载体的构建含有 2CaMV35S 启动子、增强子、终止子、报告基因 gus, 卡那霉素抗性基因 npt, 左右两侧 25 bp 边界序列（图 1） ，通过冻融法转化到农杆菌 EHA105 中. 2.2 烟草叶片的转化及转化植株再生体系的建立 2.2.1 转基因烟草植株的再生浸染过含人野生型 p53 基因的农杆菌菌液的烟草叶片在附加 200 mg/L 头孢曲松钠、100 mg/L 卡那霉素的选择培养基上培养 14 d 左右，叶片边缘处膨大，长出抗性愈伤组织，将其切下转入新的选择培养基中，抗性芽继续生
16、长，一部分黄化死亡，另一部分生长为正常的绿色芽，当不定芽长至 35 cm 时转入新的选择培养基，部分小苗可长大并产生不定根，发育为完整的再生植株（图 2） ，即 Km 抗性表型的再生植株. 2.2.2 抗生素头孢曲松钠在转基因烟草中的作用 当头孢曲松钠的浓度为 200 mg/L 时，抑菌率、愈伤组织诱导率和不定芽平均增殖率都达到最高，之后随着浓度的增加愈伤组织诱导率和不定芽平均增殖率有所下降. 2.3 转基因烟草植株的检测 具有 GUS 酶活性（图 2F） ，GUS 基因已经整合进入烟草基因组，并且能够稳定表达，与 GUS 基因相连的目的基因人野生型 p53 基因也转化到烟草基因组中； 盆栽的
17、 12 株抗性再生植株经 PCR 扩增反应均能扩增出 1039 bp 的预期 DNA 片段(图 4)； 对 PCR 检测阳性的转化植株随机选取 8 株，提取总基因组 DNA显示 Southern Blot 阳性率为 87.5%（获得 7 株转基因植株） ，表明外源人野生型 p53 基因已经整合到烟草基因组中（图 5）. 3 讨论 人类 p53 基因的缺失或失活与 50%以上肿瘤的发生、发展相关，基因突变是 p53 基因正常功能丧失的最主要方式，大量体外培养细胞和动物模型都证实了外源的 wtp53 导入后，肿瘤细胞增殖减慢，细胞发生凋亡，瘤体体积缩小，对放、化疗药物的敏感性增高6-7. 因此获得
18、大量、廉价、安全且具有正常功能的 wtp53 基因便成为 p53 抑癌基因治疗的首要任务. 利用转基因植物作为生物反应器生产重组药用蛋白具有常规的微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统不可比拟的潜在优越性，目前已有人胰岛素、免疫球蛋白、干扰素、人表皮生长因子、尿激酶、葡萄糖脑苷脂酶、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、人生长激素脑啡肽等多种药用蛋白在转基因植物中表达并生产8. 本实验构建了人野生型 p53 肿瘤抑制基因的植物表达载体 pCAMBIA2301/p53，该载体具有完整的植物表达调控元件，如组成型启动子 2CaMV35S,连接外源基因的多克隆酶切位点，卡那霉素抗性基因 npt,标记基因
19、gus 及左右边界序列，可与农杆菌中的 Ti 辅助质粒构成植物双元表达载体，适用于根瘤农杆菌介导的植物转化，并获得了大量抗性植株. 经组织化学法, PCR, Southern 杂交检测，表明人野生型 p53 基因已整合到转基因烟草植株的基因组中，获得了含人野生型 p53 基因的烟草转化植株，为进一步检测p53 基因的生物活性奠定了基础. 农杆菌介导的基因转化中常用的抑菌抗生素由于其种类较多，抑菌效果也有差异. 这些抗生素不仅对农杆菌有杀伤或抑制作用，而且对植物细胞组织同样有一定的生物效应9. 本实验选用的抑菌抗生素头孢曲松钠为第三代头孢类抗生素，是目前半衰期最长的头孢菌素之一，属于 内酰胺类抗
20、生素，是分子结构中含有头孢烯结构的合成半合成抗生素，它与青霉素类结构的不同在于母核 7 氨基头孢烷酸 (7ACA) 取代了 6 氨基青霉烷酸 (6APA) ，这种差异使头孢类抗生素可以耐青霉素酶，其作用机理与青霉素类相似，为繁殖期强效杀菌剂，可与蛋白结合抑制转肽酶交联反应，从而阻碍细胞壁粘肽的合成，使细菌的细胞壁缺损，菌体高渗膨胀裂解，进而诱导粘肽水解酶激活而溶菌. 本实验中头孢曲松钠在适宜的浓度下，抑制农杆菌生长的同时能提高烟草愈伤组织诱导率和丛生芽诱导率，有类似激素的活性. 【参考文献】 1高丰，宋今丹. p53 家族新成员研究进展J. 国外医学遗传学分册,2000,23 (2):66-7
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