1、塞来昔布对宫颈癌 HeLa 细胞放射增敏效应的观察作者：宫文静 何信佳 于丽 安永恒 【摘要】 目的 探讨环氧合酶 2（COX2 ）抑制剂塞来昔布对人宫颈癌 HeLa细胞株的放射增敏作用及其机制。方法 MTT实验测定塞来昔布对宫颈癌 HeLa细胞的毒性，筛选出塞来昔布的半数抑制浓度（IC50） ，实验分为不同浓度药物组（10、20、40、80 mol/L） 、对照组和空白组。克隆形成实验检测 20% IC50浓度的塞来昔布对 HeLa细胞的放射增敏作用，实验分为空白对照组、单纯放射组（2、4、6、8 Gy） 、单纯加药组（药物浓度为 20% IC50） 、放射加药组（20% IC50药物浓度+
2、2、4、6、8 Gy放射剂量） ，根据各组的克隆形成率，计算放射敏感性相关参数；流式细胞仪（FCM）分析细胞周期的分布情况，实验分为对照组和药物组（药物浓度为 20% IC50） 。结果 MTT实验显示塞来昔布对 HeLa细胞毒性呈现出浓度和时间依赖性，72 h 的 IC50是 44 mol/L；克隆形成实验显示，放射加药组与单纯放射组相比，反映放射敏感性的指标平均致死剂量（D0） 、准域剂量（Dq） 、2 Gy照射的存活分数（SF2）均下降，放射增敏比（SER）升高。流式细胞术检测细胞周期 S期细胞明显减少，G0G1 期细胞增多，细胞阻滞于 G1期。结论塞来昔布能增强宫颈癌 HeLa细胞的放
3、射敏感性，其机制可能与促进细胞凋亡、抑制肿瘤细胞亚致死性损伤修复和促进肿瘤细胞周期再分布有关。 【关键词】 塞来昔布；宫颈肿瘤；辐射增敏药 ABSTRACT Objective To investigate the effect of celecoxib, an inhibitor of cyclooxygenase2 (COX2), on radiosensitivity enhancement of human cervical cancer HeLa cells and its mechanism. Methods MTT assay was used to measure the pr
4、oliferation inhibition of celecoxib on HeLa cells and determine the concentration IC50 of celecoxib. The cells were randomized to three groups: drug group (10, 20, 40, 80 mol/L), control group and blank group. The cells were treated in vitro with different doses of radiation alone （0, 2, 4, 6, 8 Gy）
5、, celecoxib (20% IC50) alone and radiation combined with celecoxib administrated. The clonogenic assay was performed to determine the radiosensitivity effect of celecoxib on HeLa cells with the concentration of 20% IC50. The cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry (FCM) to compare con
6、trol group with drug group. Results Inhibition of celecoxib on HeLa cell proliferation was dose and time dependent. Values of SF2, D0, Dq, SER displayed the group of radiation combined with celecoxib were significantly lower than those of radiation alone group. Cell population in G0/G1 phase increas
7、ed and in S phase decreased. Conclusion Celecoxib can increase the radiosensitivity of HeLa cells in cancer of the cervix, which is probably associated with promotion of apoptosis, inhibition of sublethal damage of tumor cells and facilitation of redistribution of tumor cell cycle. KEY WORDS celexco
8、xib; cervix neoplasm; radiation sensitization agents 宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，其发病率在妇女恶性肿瘤中居第二位1。放射治疗是宫颈癌的主要治疗手段，a 期以上多采用放疗。但是肿瘤细胞内在的敏感性、乏氧程度等，使肿瘤对放疗的敏感性存在着差异，而增加肿瘤的放射敏感性成为肿瘤放射治疗领域一直关注的问题。选择性环氧合酶 2（COX2 ）是花生四烯酸代谢合成前列腺素过程中的限速酶，参与了许多重要的生理病理过程。已有研究显示，COX2 在多种恶性肿瘤组织中呈高表达。某些刺激因子如癌基因产物、某些生长因子和辐射等都可诱导 COX2 的表达，而高表达的
9、 COX2 会促进细胞增殖，抑制细胞凋亡23 。最近研究显示，COX2 抑制剂在体内外都有放射增敏作用，其确切机制尚不明确45 。本实验以 COX2 抑制剂塞来昔布配合放疗作用于体外培养的宫颈癌 HeLa细胞，观察其对细胞的增殖抑制作用以及放疗的增敏作用，并探讨其可能机制，以期提高宫颈癌的放疗效果。现将结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂 人宫颈癌细胞株 HeLa细胞由青岛大学医学院微生物学教研室提供；高糖 DMEM和胰蛋白酶由 GIBCO BRL公司提供；胎牛血清由杭州四季青生物公司提供；四甲基偶氮唑盐（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）购自 Sigma公司；选择
10、性 COX2 抑制剂塞来昔布（纯度为 99%）由南京德宝生化器材有限公司提供。 1.1.2 主要仪器 二氧化碳培养箱，AIRTECH 超净工作台，紫外线可见分光光度计，电子直线加速器，倒置显微镜，流式细胞仪。 1.1.3 细胞培养 人宫颈癌细胞株 HeLa细胞置于含有体积分数 0.10胎牛血清、青霉素和链霉素各 100 kU/L的高糖 DMEM培养液中，37 、体积分数 0.05 CO2饱和湿度孵箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。 1.2 方法 1.2.1 塞来昔布细胞毒性实验 应用 MTT实验。取对数生长期细胞，每孔 5103个接种于 96孔培养板培养 24 h。贴壁后，更换含不同浓度塞来
11、昔布（10、20、40、80 mol/L）培养液，同时设对照组(含有细胞和培养液但不加塞来昔布)和空白组（只有培养液，不含有细胞和塞来昔布） ，分别继续培养24、48、72 h,各组设 6个复孔。各组药物作用结束后，弃去培养液，每孔各加入 100 L 培养液和 10 L 的 MTT,继续培养 4 h后，加 150 L DMSO,避光震荡 10 min,紫外线可见分光光度计测各孔 490 nm处的吸光度（A）值。实验重复 3次。计算各组的细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（1-实验组 A值/对照组 A值）100%，根据半数抑制浓度（IC50）计算软件计算塞来昔布作用 HeLa细胞后 50%细胞生长
12、抑制的浓度，即IC50。 1.2.2 放射敏感性测定 药物配制：以 DMSO溶解塞来昔布粉剂，配成 9 mmol/L母液，用时稀释至所需浓度。实验分成 4组。空白对照组：不做任何处理；单纯放射组：设不同照射剂量（2、4、6、8 Gy）亚组；单纯加药组：为了避免药物对细胞的毒性作用，药物浓度取 20% IC50（9 mol/L） ；放射加药组：9 mol/L 的塞来昔布并进行 2、4、6、8 Gy 不同剂量照射。取对数生长期的 HeLa细胞，以每皿 1105个接种培养 24 h。细胞贴壁后，更换新鲜培养液（单纯加药组、放射加药组培养液含 9 mol/L 塞来昔布） ，继续培养 72 h后，单纯放
13、射组和放射加药组分别予以不同剂量照射。照射后，培养皿置于体积分数 0.05 CO2孵箱中培养 4 h。根据不同照射剂量（08 Gy） ，接种 200、200、200、500、500 个细胞到 6孔板（每一剂量点设 3个平行孔）培养 12 d，低倍镜下计数大于 50个细胞的克隆数。实验重复 3次。应用克隆形成实验法计算细胞存活分数，克隆形成率（PE）=集落数/接种细胞数100%；存活分数（SF）=某一剂量照射组的集落数/（该组细胞接种数未照射组克隆形成率） 。以多靶单击模型拟合细胞存活曲线，并计算细胞放射敏感性参数：平均致死剂量（D0） 、准域剂量（Dq） 、2 Gy照射的存活分数（SF2） 、
14、外推数（N）以及放射增敏比（SER） 。这些参数越高，表示细胞对放射线的抵抗性越高。1.2.3 流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡 取对数生长期细胞接种于 6孔板（细胞密度为每孔 5105）中，分对照组和药物组。细胞贴壁后，对照组更换无药培养液，药物组换含 9 mol/L 塞来昔布的培养液。培养 72 h后，用 PBS制成单细胞悬液，用体积分数 0.70乙醇固定 24 h以上，碘化丙啶染色，在 FCM上检测，Modifit软件分析所得数据。实验重复 4次。 1.3 统计学处理 应用 SPSS及 PPMS 1.56统计学软件进行数据处理，结果用s 表示，组间比较采用配对 t检验。P0.05 为差异
15、有统计学意义。 2 结果 2.1 不同浓度塞来昔布作用 HeLa细胞不同时间的增殖抑制率比较 塞来昔布对 HeLa细胞增殖抑制呈现浓度、时间依赖性(图 1)。根据塞来昔布对 HeLa细胞的生长抑制率计算其作用 72 h的 IC50是 44 mol/L。20% IC50（9 mol/L）的塞来昔布作用 72 h对 HeLa细胞毒性较小，可作为放射增敏浓度进行研究。 2.2 克隆形成实验结果 单纯放射组的 SF2、D0、Dq 分别为 0.67、4.10、0.63；放射加药组的 SF2、D0、Dq 则分别为 0.30、1.67、0.01。由 D0所得 SER为 2.5。放射加药组肩区小于单纯放射组，
16、说明细胞亚致死性损伤修复能力降低。多靶单击模型拟合细胞存活曲线见图 2。存活曲线放射加药组较单纯照射组左移。 2.3 塞来昔布对宫颈癌 HeLa细胞周期的影响 药物组 HeLa细胞的细胞周期发生改变，G0G1 期细胞比例增多，而S 期细胞比例减少，差异有显著性（t=33.83、13.76,P0.05） ；G2M 期细胞比例无明显变化。见表 1。表 1 塞来昔布对宫颈癌 HeLa细胞周期的影响（略） 3 讨论 放射治疗在肿瘤的综合治疗中发挥着重要的作用，随着放疗技术的提高和放疗设备的改进，放射治疗比有所提高，但是由于花费过高，限制了它们的使用，因此如何采用经济的方法提高放射治疗比一直备受关注。以
17、前我们常使用顺铂作为宫颈癌的放疗增敏剂来提高放疗疗效，但是其肾及消化道毒性较大，限制了其应用。因此，寻找一种高效低毒的放射增敏剂，提高肿瘤的放射治疗比就显得尤为重要。 环氧合酶（COX）在人体内存在结构型 COX1 和诱导型 COX2 。其中 COX1 是由管家基因编码，在正常组织中常有表达，维持机体的生理病理过程；COX2 由某些刺激因素诱导产生，在许多肿瘤组织和癌前病变组织中过表达，它的主要产物前列腺素 2（PGE2）可以拮抗电离辐射所造成的细胞毒性反应。COX2 的表达水平与肿瘤的分期、浸润程度、恶性程度以及预后密切相关7。COX2 抑制剂与放疗敏感性有关89 。 既往研究结果显示，使用
18、 COX抑制剂可以降低结肠癌、食管癌和胃癌的发病率，但其对消化道黏膜的损伤影响了使用。塞来昔布也是非甾体类抗炎药，属于选择性 COX2 抑制剂，它可以选择性地阻断 COX2 ，而不阻断 COX1 ，从而减少传统非甾体类抗炎药如阿司匹林、吲哚美辛等对消化道黏膜的损伤。本研究 MTT实验结果表明,随着时间梯度和浓度梯度的升高，塞来昔布对 HeLa细胞的抑制率逐渐升高。放射治疗的目的是抑制肿瘤的继续生长，阻止肿瘤细胞的繁殖传代，因此鉴别细胞存活的唯一标准是，受照射后细胞是否保留无限增殖的能力，即是否具有再繁殖完整性。在体外培养的细胞中，一个存活的细胞可以分裂繁殖成一个细胞群体，称集落或克隆。所以，本
19、实验采用集落形成实验来检测塞来昔布对 HeLa细胞的生长抑制的影响。多靶单击模型常用来衡量细胞的放射敏感性,Dq 表示细胞对亚致死性损伤修复能力的大小。肿瘤细胞亚致死性损伤修复在细胞存活曲线上表现为肩区。本文放射加药物组的SF2、D0、Dq 均明显降低，从而证明加入塞来昔布可抑制肿瘤细胞放射后亚致死性损伤的修复,增加放射敏感性。FCM 实验结果显示，加药组的HeLa细胞的细胞周期发生改变，塞来昔布将细胞阻滞在 G0G1 期，进入S期的细胞明显减少，从而抑制肿瘤细胞的生长。提示塞来昔布不仅可以抑制肿瘤细胞增殖，还可以增强放疗敏感性。 综上所述，COX2 抑制剂的放疗增敏的机制比较复杂。其可能的机
20、制为：诱导肿瘤细胞的凋亡；抑制肿瘤细胞亚致死性损伤修复；促进肿瘤细胞周期再分布。 【参考文献】 1ZHANG B, LIU J Y, PAN J S, et al. Combined treatment of ionizing radiation with genistein on cervical cancer hela cellsJ. J Pharmacol Sci, 2006,102(1):129135. 2JIANG J G, TANG J B, CHEN C L, et al. Expression of cyclooxygenase2 in human esophageal squ
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