1、山莨菪碱对脂多糖结合血管内皮细胞及诱导 NO 合成的抑制作用【关键词】 山莨菪碱 关键词: 山莨菪碱;内皮，血管;脂多糖类;一氧化氮 摘 要:目的 实验观察山莨菪碱对细菌脂多糖（LPS）结合血管内皮细胞膜及诱导 NO 生成的影响. 方法 体外分离培养牛主动脉血管内皮细胞，用免疫组化显色反应显示细菌脂多糖与血管内皮细胞的结合，并通过图像分析对结果进行半定量;用高压液相色谱分析细胞培养液中 NO 3- 的含量，间接反应 NO 的生成水平. 结果 细胞分组处理，间接法显色后图像分析，结果表明山莨菪碱组的平均灰度值明显低于 LPS 组（P0.05）;并且对细胞培养液中 NO 3- 的检测显示山莨菪碱组
2、的浓度明显低于 LPS 组（P0.05）. 结论 山莨菪碱能够抑制 LPS 结合血管内皮细胞，并且能够抑制 LPS 对NO 合成的诱导作用. Keywords:anisodamine;endothelium，vascular;lipopolysac-charides;nitric oxide Abstract:AIM To investigate the effect of anisodamine on lipopolysaccharides attached to the membrane of endothelium and inducing the releasing of nitric
3、 oxide（NO）.METHODS The bovine aortic endothelial cells（BAEC）were isolated and cultured for study.The lipopolysaccharides（LPS）at-tached to the membrane of endothelium was detected by im-munocytochemistric means.The NO 3- level which reflected the releasing of NO in culture medium was determined by hi
4、gh-performance liquid chromatography.RESULTS Af-terbeing treated with LPS，the group incubating with aniso-damine showed there had less LPS attached on than the group treated with LPS only.And the NO 3- level of the group in-cubating with anisodamine was lower than the group treated with LPS only.And
5、 the NO 3- level of the group incubating with anisodamine was lower than the group treated with LPS only.CONCLUSION This result suggests that anisodamine can significantly inhibit the LPS attached to the membrane of endothelium and inducing the releasing of NO. 0 引言 研究与临床实践证明大剂量的山莨菪碱对于抢救内毒素休克有效，其研究的
6、结果表明其抗休克的作用机制主要在细胞水平上.近年对大肠杆菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）识别结合细胞膜上受体，引发各种病理生理过程的研究日渐深入.本实验旨在通过体外培养血管内皮细胞，观察山莨菪碱对 LPS 结合血管内皮细胞膜上受体以及诱导 NO 合成的影响，以此进一步揭示山莨菪碱抗内毒素休克的作用机制. 1 材料和方法 1.1 材料 药品与试剂:型胶原酶;正辛胺（n-octylamine）;大肠杆菌脂多糖 E.coil O11B4（lipopolysaccharides，LPS，美国 Sigma 公司）;RPMT-1640 培养基（美国 Gibco 公司）;抗 LPS
7、 单克隆抗体参照马越云等1 建立的方法制备;因子相关抗原抗体与 CD14 单克隆抗体（武汉博士德生物技术公司）;辣根过氧化酶（HRP）标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体（华美生物工程公司）;盐酸消旋山莨菪碱（芜湖长江药业有限公司产品，批号 9806192）.地塞米松（天津药业有限公司）;仪器设备:高压液相色谱仪（美国 Beckman 公司）;CMIAS 系列-多功能彩色病理图像分析系统（北京航空航天大学图像中心）. 1.2 方法 细胞培养与鉴定:无菌条件下取牛主动脉血管 1015cm，管腔注入1g L-1 型胶原酶，37消化 20min，收集消化液，离心洗涤细胞 2 次，计数，以 1108 L-1
8、 细胞数接种于含 200g L-1 小牛血清的 1640 培养液，5mL L-1 CO 2 ，37条件下培养，胰酶消化传代，实验用 610 代细胞.培养细胞用因子相关抗原单克隆抗体检测呈阳性;内皮细胞膜结合:LPS-sCD14 复合物的检测细胞均匀爬片，每 8 张一组，分 4 组:空白对照组，LPS 组，山莨菪碱组，CD14 抗体组.其中山莨菪碱组含山莨菪碱25mg L-1 ;CD14 抗体组含抗 CD14 单克隆抗体 3mg L-1 .;除空白对照组以外，各组的培养液中均含 LPS1.0mg L-1 .药物在含 200g L-1 小牛血清的 1640 培养液中作用 4h 后，40g L-1
9、中型甲醛固定细胞，抗 LPS 单克隆抗体（50mg L-1 ）检测结合于细胞膜上的 LPS，用间接法进行免疫组化染色，由辣根过氧化物酶-DAB 系统显色.在 CMIAS 系列-多功能彩色病理图像分析仪上进行计算机辅助图像分析;细胞培养液的处理:细胞以 210 5 /孔浓度均匀接种到 24 孔板中，贴壁生长.每 20 孔一组分为4 组:空白对照组，LPS 组，山莨菪碱组，地塞米松组.其中山莨菪碱组含山莨菪碱 50mg L-1 ;地塞米松组含地塞米松 60mg L-1 ;除空白对照组以外，各组的培养液中均含 LPS10mg L-1 .于 200mL L-1 小牛血清的 1640培养液中培养.各组分
10、别在实验开始 4，8，16，32h 时各取 5 孔培养液，每孔 1mL.经三氯乙酸除蛋白并过滤后于-20保存待测;细胞培养液NO3- 浓度的检测:参照 Rizzo 等2 的高压液相检测方法，选取250mm4.6mm C18 柱为色谱柱，以 10nmol L-1 n-octy-lamine 为流动相（2nmol L-1 H2 SO4 调 pH 值至 6.00.2） ，检测波长 220nm.流动速度 1mL min-1 .统计处理:数据以 x s 表示，两组实验数据分别做 t 检验与多因素方差分析（ANOVA）. 2 结果 2.1 山莨菪碱对 LPS 结合血管内皮细胞的影响 在 CMIAS 系列-
11、多功能彩色病理图象分析仪上，200 倍视野下，每张片子分别随机观察记录 1 个视野，记录所测细胞的平均灰度值.灰度单位分为 256 个等级，LPS 与血管内皮细胞的结合量与灰度值呈反比关系（Fig1（略） ）. 2.2 山莨菪碱对 LPS 诱导血管内皮细胞 NO 合成的影响 NO 的半衰期极短，很快被氧化为 NO2- /NO3- ，并且 NO2- 可进一步氧化为 NO3- （Tab1）. 表 1 不同实验组的细胞培养液中 NO（略） 3 讨论 G- 细菌引起感染性休克的主要致病因素为其菌体的 LPS，进入体内后与血浆中的 LBP 蛋白、sCD14 蛋白结合形成 LPS-sCD14 复合物，以复
12、合物的形式与内皮细胞膜上相应受体结合3 ，其中 sCD14 蛋白在 LPS与其膜受体结合的过程中起关键性作用.相应的 CD14 单克隆抗体可以有效的抑制 LPS 与其膜受体结合、诱导一系列的细胞反应4 .本实验中山莨菪碱表现了与 CD14 单克隆抗体类似的作用，能够抑制 LPS-sCD14 复合物与血管内皮细胞的结合.LPS 结合血管内皮细胞可诱导其合成释放大量的 NO，使血管平滑肌的 K+ 离子通道开放，平滑肌舒张，血压下降，并使血管对儿茶酚胺的反应性降低，这是造成内毒素休克患者持续性低血压的重要原因5，6 .实际上，用地塞米松、NG- 单甲基-L-精氨酸（L-NMMA）等药物阻断 NO 的
13、生成可以明显的改善内毒素休克动物的持续低血压状态7 .山莨菪碱阻碍 LPS-sCD14 复合物与血管内皮细胞的结合必然对 LPS 诱导的 NO 生成具有抑制作用，从而对内毒素休克时的持续低血压状态起到改善作用，相应的 CD14 单克隆抗体也在实验中证明有相同的作用8 .由此实验我们认为，山莨菪碱在较高浓度的条件下对LPS 结合内皮细胞膜上的相应受体具有抑制作用，此作用是通过哪一种途径产生还尚不明了，有待进一步的研究. 参考文献: 1Ma YY，Ding ZR，Yu WB，Su MQ，Mu SJ.Cross-reactivities of Monocolonal antibodies again
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