1、石蜡切片中 BCL6 抗原失活机制及修复作者：张永清 黄高升日 赵一岭 王哲 闫庆国 郭英 【关键词】 抗原修复 关键词: 抗原修复;免疫组织化学;BCL-6;淋巴组织增生 摘 要:目的 探讨石蜡切片中 BCL-6 抗原失活机制及修复的最佳方法. 方法 淋巴组织反应性增生 11 例石蜡切片分别用二乙胺四乙酸（EDTA） 、柠檬酸、碳酸钠及去离子水 4 种与钙离子结合力不同的修复液，结合高压、微波和煮沸 3 种不同方法修复后，比较检出的 BCL-6 阳性率及强度. 结果 BCL-6 阳性率由高至低依次为:EDTA0.73柠檬酸0.45（P0.01）碳酸钠 0.12（P0.01） ，去离子水组无
2、1 例阳性.高压修复阳性率 0.55微波修复 0.28 和煮沸修复0.12（P0.05）.不同修复液与高压结合修复检出 BCL-6 阳性率及强度:EDTA 与柠檬酸阳性率分别为 1，0.82（P0.05） ，高于碳酸钠组（0.36）和去离子水组（0） （P0.01）.EDTA 组强阳性占 0.82，显著高于其他各组（P0.01）. 结论 EDTA 结合高压是修复 BCL-6 抗原的理想方法，钙离子的参与可能是甲醛固定后 BCL-6 抗原失活的原因之一. Keywords:antigen retrieval;immunohistochemistry;BCL-6;lymphoproliferati
3、on Abstract:AIM To study the ideal method of retrieving the antigenic activity of BCL-6in paraffin sections and the possible mechanism of the antigen masking.METHODS Paraffin-embedded sections from11cases of lymphoid reac-tive hyperplasia were retrieved respectively by four retrieving solutions with
4、 different combining power with calcium:ED-TA，citrate，sodium carbonate（SC）and deionized water（DW） ，which with different retrieval methods:high pressure（HP） ，microwaving（MW）and stove boiling（SB） ，and the antigenic activities were detected by immunohistochemistry.RESULTS The positive percentage in sec
5、tions retrieved by EDTA，citrate and SC were0.73，0.45and0.12respective-ly.The difference among the groups was significant（P0.01）;the group of DW showed all negative.0.55of HP group was positive，which was higher than0.28of MW group and0.15of SB group（P0.05and P0.01）.The positive incidences of sections
6、 retrieved by HP with EDTA and HP with citrate were1and0.82respectively，which were higher than HP with SC（0.36）and HP with DW（0）（P0.01）.0.82of HP with EDTA was intensive positive，the difference in positive intensity between HP with EDTA group and above mentioned groups was significant（P0.01）.CONCLUS
7、ION HP with EDTA is the ideal method for retrieving antigenic activity of BCL-6by formalin-fixa-tive， suggesting that calcium may be involved in the antigen masking. 0 引言 BCL-6 是位于染色体 3q27 原癌基因 bcl-6 编码的核内转录因子，由706 个氨基酸组成，主要表达于淋巴组织生发中心 B 细胞及部分 T 细胞1 .研究证实，bcl-6 剔除鼠不能形成生发中心2 ，其基因调控区发生易位或（和）突变与 B 细胞淋巴
8、瘤发生有关3，4 ，BCL-6 表达失调可引起细胞凋亡及弥漫性大 B 细胞淋巴瘤发生5，6 .检测BCL-6 表达有助于淋巴瘤的诊断和鉴别诊断7 .然而，40gL-1 甲醛固定后的 BCL-6 抗原不经修复极难检出.我们用免疫组化方法比较一组反应性增生淋巴组织石蜡切片，分别用 EDTA、柠檬酸、碳酸钠及去离子水 4 种修复机制不同的修复液，结合高压、微波及煮沸 3 种常用方法的修复效果，探讨 BCL-6 抗原失活机制及修复的理想方法. 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 标本来源及处理 2000-02/2000-06 收集西京医院病理科扁桃体炎标本 7 例，反应性增生淋巴结标本 4 例.
9、经 40gL-1 甲醛固定 24h，常规石蜡包埋，4m 厚连续切片，切片置 60烤箱过夜（切片用 APES 胶预处理）. 1.1.2 修复液及配制 1mmolL-1 pH8.0ED-TA 溶液:0.37g EDTA 溶于 1L 蒸馏水，调 pH 值至 8.0;10mmolL-1 ，pH6.0 柠檬酸盐溶液、1.5mmolL-1 pH8.0 碳酸钠溶液分别参照 Cattoretti等9 及 Morgan 等8 的方法配制;去离子水用美国 Millipore 公司制纯水器生产. 1.2 方法 高压修复参照 Norton 等10 方法:1.5L 修复液入压力锅中，加热至沸腾.将脱蜡至水切片置于金属架
10、上，浸入锅内修复液中，盖压力锅阀，加热至压力锅喷气后 1min，停止加热，冷水浸至室温.微波修复参照 Cattoretti 等9 方法:将脱蜡至水切片放入盛有修复液的染缸中，置医用微波炉内中低档加热 10min，取出冷却至室温.煮沸修复法:将脱蜡至水切片浸入盛修复液的烧杯中，烧杯置于盛有自来水的铝锅内，电炉上加热，烧杯中温度达 97后开始计时，15min 后停止加热，冷至室温. 1.3 免疫组化检测及结果判断 BCL-6mAb 购自英国 Novocastra 公司，工作浓度 120.EnVisionTM 及催化信号扩增（catalyzed signal amplification，CSA）免疫
11、组化试剂盒购自 Dako 公司，按说明操作.11份标本各切片 13 张，分 13 组.其中一组不修复，用 CSA 试剂盒检测.另12 组用不同的修复液及修复方法修复，运用 Dako EnVisionTM 两步法检测.TBS 替代一抗作阴性对照.阳性强度评价采用半定量方法，阴性不着色（-） ，淡黄色为阳性（+） ，棕黄色颗粒或团块为强阳性（） （着色部位位于胞核）. 统计学处理:实验结果采用 2 检验. 2 结果 2.1 未经修复组检测结果 用 CSA 试剂盒检测未修复组，抗 BCL-6免疫组化染色均为阴性（Fig1）. 2.2 不同方法修复后 BCL6 检测结果 经 EDTA、柠檬酸、碳酸钠及
12、去离子水 4 种修复液，分别用高压、微波及煮沸 3 种修复方法处理后，EDTA 组阳性率显著高于柠檬酸组（P0.01） ，后者又高于碳酸钠组 和去离子水组（P0.01）.3 种修复方法比较，高压修复阳性率高于微波修复组（P0.05）和煮沸组（P0.01）.且高压修复无组织脱片现象，其他修复方法均有不同程度的脱片（Tab1）. 图 1 图 2 略 表 1 不同方法修复后 BCL-6 检测结果 略 2.3 高压配合不同修复液的修复效果 EDTA 或柠檬酸结合高压修复方法，检出 BCL-6 阳性率分别为 100%和 81%（P0.05） ，显著高于碳酸钠组及去离子水组（Tab2，P0.01）.EDT
13、A 组 11 例阳性中有 9 例为强阳性表达（Fig2） ，高于其他各组（P0.01，Tab2）. 3 讨论 用灵敏度 50 余倍标准 LSAB（labeled strepta-vidin biotin）的CSA 试剂盒（见说明书）检测未经修复的 11 例石蜡切片，结果全为阴性，提示 100gL-1 甲醛固定后的石蜡切片中 BCL-6 抗原活性基本丢失.较多研究认为石蜡切片不能较好地显示抗原的原因，不是抗原破坏，而是抗原受到遮蔽.不同抗原遮蔽的主要原因亦不相同，因此所用的修复液和修复方法也应有所不同9 .Morgan 等8 推测引起抗原遮蔽的主要原因有:40gL -1 甲醛固定过程中产生的甲酸
14、可与某些蛋白质位点发生十字交联形成亚甲基桥.高温下这种亚甲基桥可在水溶液中水解，抗原活性重新暴露.一些蛋白质在 40gL-1 甲醛固定和高温浸蜡过程中，其三级结构发生改变，使原本暴露的抗原隐藏起来.某些蛋白质在 40gL-1 甲醛固定时产生大量羟基、羧基及磷酰基基团，这些基团易与动物组织中丰富的钙离子紧密结合形成复合物，引起抗原遮蔽. 表 2 不同修复液结合高压修复后检出 BCL-6 的阳性状况 略 用 BCL-6mAb 检测经修复后淋巴组织石蜡切片中 BCL-6 抗原表达情况，国外虽有报道，但所用修复液及修复方法各不相同11，12 ，目前尚未见探讨 40gL-1 甲醛固定后 BCL-6 抗原
15、失活机制及理想修复方法的报道.我们用微波、高压、煮沸 3 种常用修复方法对 4 种修复机制不同的修复液的修复效果进行了比较，发现 EDTA 溶液对 40gL-1 甲醛固定后的 BCL-6 抗原活性修复能力最强，其次为柠檬酸溶液，碳酸钠盐只有较弱的修复作用，去离子水没有修复作用.EDTA 和柠檬酸均为钙离子强螯合剂.碳酸钠盐亦有钙离子沉淀作用.而去离子水无结合钙离子作用.以上结果表明，经 40gL-1 甲醛固定后石蜡切片中 BCL-6抗原失活的主要机制可能与钙离子复合物形成有关.对 4 种不同的修复液结合 3 种常用修复方法的修复效果进行检验表明，高压修复效果最好，可能在高压状态下钙离子与蛋白质
16、抗原形成的复合物更易解离.对 4 种修复液结合高压修复的效果进行验证，发现差异悬殊.EDTA 溶液结合高压修复法修复 BCL-6 抗原后，其检出阳性率及阳性强度均高于其他各组，是修复石蜡切片中 BCL-6 抗原活性 的最隹方法.此法经济方便，操作简单，为进一步研究 BCL-6 抗原失活及修复机制，以及研究其表达意义打下了良好基础. 参考文献: 1Ye BH，Lista F，Lo coco F，Knowles DM，Offit K，Chaganti RS，Dalla-favera R.Alterations of a zinc finger-encoding gene，BCL-6，in diff
17、use large-cell lymphoma J.Science，1993;262:747-750. 2Dent AL，Shaffer AL，Yu X，AllmanD，Standt LM.Control of inflammation，cytokine expression，and germinal center forma-tion by BCL-6J.Science，1997;276:589-592. 3Capello D，Vitolo U，Pasqualucci L，Quattrone S，Migliaretti G，Fassone L，Ariatti C，Gaidano G.Dist
18、ribution and pattern of bcl-6mutations throughout the spectrum of B-cell neoplasia J.Blood，2000;26:651-659. 4Yoshida S，Kaneita Y，Aoki Y， Seto M，Mori S，Moriyama M.Identification of heterologous translocation partner genes fused to the bcl-6gene in diffuse large B-cell lymphomas:5-RACE and LA-PCR anal
19、yses of biopsy samples J.Oncogene，1999;18:7994-7999. 5Albagli O，Lantoine D，Quief S，Quignon F，Englert C，Kerck-aert Jp，Montarras D，Pinset C，LindonC.Overexpressed BCL-6（LAZ3）oncoprotein triggers apoptosis，delays S phase pro-gression and associates with replication foci J.Oncogene，1999;18:5063-5057. 6Ta
20、o K，Zhu XZ.Bcl-6and diffuse large B-cell lymphoma J.Zhonghua Binglixue Zazhi（Natl Path J Chin） ，1998;27（6）:465-466. 7Falini B，Fizzotti M，Pileri S，Liso A，Pasqualucci L，Flenghi L.BCL-6protein expression in normal and neoplastic lymphoid tissues J.Ann Oncol，1997;8（Suppl2）:101-104. 8Morgan JM，Navabi H，S
21、chmid KW，Jasani B.Possible role of tissue-bound calcium ions in citrate-mediated high-temperature antigen retrieval J.J Pathol，1994;174:301-307. 9Cattoretti G，Pileri S，Parravicinic，Becker MH，Poggi S，Biful-co C，Key G，DAmato L，Sabatlini E，Fendale E.Antigen un-masking on formalin-fixed，paraffin-embedde
22、d tissue sections J.J Pathol，1993;171:83-89. 10Norton AJ，Jordan S，Yeomans P.Brief，high-temperature heat denaturation（pressure cooking）:A simple and effective method of antigen retrieval for routinely processed tissues J.J Pathol，1994;173:371-379. 11Flenghi L，Bigerna B，Fizzotti M，Venturi S，Pasqualucc
23、i L，Pileri S，Ye BH，Gambacorta M，Pacine R，Baroni CD，Falini B.Monoclonal antibodies PG-B6a and PG-B6p recognize，re-spectively，a highly conserved and a formal-resistant epitope on the human BCL-6protein amino-terminal region J.Am J Pathol，1996;148（5）:1543-1555. 12Falini B，Bigerna B，Pasqualucci L，Fizzotti M，Martelli MF，Pileri S，Pinto A，Carbone A，Venturi S，Flenghi L.Distinc-tive expression pattern of the BCL-6protein in nodular lympho-cyte predominance Hodgkins disease J.Blood，1996;87（20）:465-470.
