1、实验性蛛网膜下腔出血后兔脑血管内皮素受体 A 的表达及意义【摘要】 目的: 探讨蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管内皮素受体A（ETRA）的表达与迟发性脑血管痉挛(DCVS)之间的关系. 方法: 将日本大耳白兔 31 只随机分为 SAH模型组 15只，盐水组 10只，穿刺组 3只，空白组 3只. 采用枕大池二次注血法制作 SAH的动物模型，灌注处死后取基底动脉制成切片. 进行 ETRA免疫组化染色，图像分析法测量血管周长，用方差分析进行统计学检验. 结果: 在空白组、穿刺组和盐水组的基底动脉内 ETRA有少量表达；SAH 组基底动脉内 ETRA的表达在 3 d组最强烈，其中血管内皮细胞表达最强烈
2、，平滑肌也有表达，10 d组的表达强度仍然较重. 空白组动物的基底动脉内皮细胞完整，弹力膜无皱缩，管壁薄管腔大. SAH组和空白组的血管在图像上差异较大. 通过对 SAH组内各时间段标本的血管周长进行图像分析，对数据进行方差分析，SAH 后血管周长的变化为：1 h组稍有变化、3 d组管径开始变小，弹力膜出现皱缩；5 d组管腔变化最严重，弹力膜明显皱缩； 7 d，10 d组血管表现出由痉挛到缓解的过程. 脑血管痉挛最严重的时间晚于脑血管 ETRA表达最强的时间. 对盐水组血管周长统计数据进行方差分析，各时间段之间差异无显著性. 结论: SAH后脑血管 ETRA的高度表达可能是引起 DCVS的重要
3、因素之一. 【关键词】 蛛网膜下腔出血；脑血管；受体 A,内皮素 【Abstract】 AIM: To study the expression of endothelin receptor A (ETRA) on the brain vessel after subarachnoid hemorrhage (SAH) and its relationship with the delayed cerebral vasospasm. METHODS: Thirtyone Japanese rabbits were randomized into SAH group (n=15), normal
4、 saline group (n=10), puncture group (n=3) and blank group (n=3). The SAH animal model was made by infusing the blood into the cisterna magna twice. And then the basilar artery was harvested after the animals were sacrificed by perfusion. ETRA immunohistochemistry was used to stain the tissue, and t
5、he image analysis was employed to measure the circumference of the vessel. After that, the statistical analysis was performed by the analysis of variance. RESULTS: ETRA was expressed on the basilar artery in both blank group and puncture group. It was mainly located on the vascular endothelial cells
6、. ETRA was also expressed on the basilar artery in the saline group. The expression was strong on the endothelial cells of basilar artery in the SAH group, especially at 3 d. Smooth muscle cells also expressed ETRA. Endothelial cells in the blank group were complete; elastic membrane didnt collapse.
7、 The circumference of the vessel in blank group and SAH group showed great difference by the statistical analysis (P0.05). In the SAH group, the vessel lumen changed severely in the 5 d subgroup; the vessel began to relieve from spasm in the 7 d and 10 d subgroup. The time when brain vessel spasm wa
8、s most severe came later than the peak time of the ETRA expression on the brain vessel. Analysis of variance revealed that there wasnt any difference in the vessel circumference among different subgroups of the saline group (P0.05). CONCLUSION: The high expression of ETRA on brain vessel after SAH m
9、ay be one of main reasons for delayed cerebral vasospasm. 【Keywords】 subarachnoid hemorrhage；cerebral vascular； receptor A, endothelin 0 引言 蛛网膜下腔出血(SAH)可导致颅内发生一系列病理生理变化，其中迟发性脑血管痉挛(DCVS)所致的迟发性缺血性神经功能障碍（DIND）是 SAH最严重的并发症，发生率高达 32%42%，现已成为 SAH后致死和致残的主要原因之一1 ， 但目前对 DCVS发生机制尚不十分明了. 近年来的研究2 发现， 内皮素1(ET1)
10、可以特异性的和内皮素受体A（ETRA）结合，引起血管的强烈收缩. 我们采用枕大池二次注血法制作兔 SAH动物模型，观察 ETRA在脑血管中的表达以及在整个 SAH病程中的动态变化规律，旨在阐明 ETRA 在 SAH后 DCVS的机制. 1 材料和方法 1.1 材料 健康、成年日本大耳白兔 31只，雌雄各半，体质量 2.32.8 kg（西安交通大学医学院实验动物中心） ；手术操作器械（西安交通大学器材科） 、250 g/L乌拉坦、40 g/L多聚甲醛；兔抗兔 ETRA mAb、免疫组化 SABC试剂盒、DAB 显色剂（武汉博士德生物试剂公司）. 1.2 方法 1.2.1 动物分组将动物随机分为
11、4组，SAH 模型组 15只，盐水组 10只，穿刺组 3只，空白组 3只. SAH模型组内又根据不同时间段分为造模后 1 h，3 d，5 d，7 d，10 d共 5亚组，每亚组 3只，盐水组按造模后1 h，3 d，5 d，7 d，10 d 分为 5亚组，每组 2只. 1.2.2 动物模型制作及取材采用枕大池二次注血法，间隔 48 h，制成兔 SAH模型. 用 250 g/L乌拉坦经兔耳缘静脉注射麻醉，初次麻醉剂量为 3 mL/kg，成功麻醉后兔角膜反射减退，疼痛刺激无反应，四肢软瘫，但呼吸平稳. 对第 2次行枕大池注血的动物麻醉时剂量减为 2 mL/kg. 将动物俯卧位，在耳正中动脉用注射器取
12、 5 mL血液，轻微振荡防止其凝固. 将兔颈部剃毛并将四肢躯干固定，触摸到枕大孔边缘后切开大约 2.5 cm的手术切口,逐层钝性分离颈部肌肉至可触摸到枕大孔骨缘和第二颈椎棘突. 用 9号腰穿针经环枕筋膜穿刺枕大池，尽量不放出脑脊液. 迅速将动脉血以 0.5 mL/s注入兔枕大池内，推注要顺利且没有明显阻力，同时观察动物注血后的表现，一般首次造模型时以 1.5 mL/kg量注入，二次造模时以 1 mL/kg量注入. 注血后迅速拔针,用纱布按压局部 1 min，并观察周围肌肉间隙内无渗血后将青霉素粉末撒在伤口局部,分层缝合肌肉和皮肤. 术毕将其按头低 30位放置以利于血液分布在基底动脉周围. 48
13、 h后以同样方法进行二次造模 . 盐水组的方法同 SAH造模组，但注入等量的 37生理盐水. 穿刺组仅分离枕部组织，行枕大池穿刺并见到 CSF流出,48 h后进行第二次穿刺. 空白对照组未进行任何手术操作. 1.2.3HE 染色在光镜下按常规观察结果，并且与免疫组织化学结果对照观察. 1.2.4 免疫组织化学染色分别将首次造模后 1 h,3 d,5 d,7 d,10 d的动物的基底动脉行免疫组织化学染色，观察 ETRA的表达. 取基底动脉中段经包埋后切片. 脱蜡至水后捞片，置于铬矾明胶片上. 放置于 37恒温箱内烘片. 使用 SABC方法，各步骤的时间和抗体及试剂计量严格按操作程序进行. 统计
14、学处理: 免疫组织化学染色以后进行图像采集，使用LeicaQ550CW 图像分析软件测量 SAH模型组和盐水组内各亚组基底动脉周长. 如果统计学上有显著性差异（P0.05）则进行亚组间 t检验. 然后比较同一时间段的盐水组和 SAH模型组的血管周长数据，对其总体均值进行 t检验. 各组基底动脉周长分别取同一血管标本相邻的两个部位测量，数据以 xs表示. 统计采用 SPSS13.0进行数据分析，同时进行图表输出. 2 结果 2.1 动物表现 SAH模型组的动物在二次注血后均出现了活动、饮水和进食减少，对刺激的反应减弱. 注血后可以即刻出现呼吸急促、四肢强直、颈项强直、肌肉细颤. 神经功能损害症状
15、主要表现为嗜睡、活动减少，走路不稳、肢体瘫痪、3 d时体质量明显下降. 症状在初次注血后 3 d最重，5 d时减轻，7 d逐渐恢复，10 d时动物已经基本恢复正常. 而穿刺组和盐水组各个时间段动物的饮食以及神经功能表现和正常组动物没有明显的区别（表 1）.表 1蛛网膜下腔出血（SAH）组和盐水组 3 d时兔的表现（略） 2.2 脑组织大体标本观察将 SAH模型组动物处死后暴露大脑基底池和小脑延髓池，在 1 h组可见广泛的 SAH，全脑未见明显的凝血块；3 d，5 d和 7 d组可见枕大池、基底池附近及基底动脉周围明显的凝血块，随时间的推移，凝血块的范围、大小和颜色呈现减退；至 10 d组枕大池
16、、基底池及基底动脉周围凝血块基本消失，但仍可见少量 SAH和蛛网膜黄染表现. 2.3 脑血管标本 HE染色 SAH模型组中基底动脉经 HE染色后在光镜下有明显改变：血管内皮细胞肿胀、脱落，内弹力膜严重皱缩，中层平滑肌层和外膜增厚，管腔狭窄. 盐水组仅可见到个别有血管内皮细胞肿胀，但是数量和程度远少于 SAH模型组. 空白对照组的基底动脉血管内皮细胞结构清晰，排列整齐，血管各层结构均匀、清晰，管腔无狭窄. 穿刺组和空白组相当，变化不明显. 2.4 免疫组化空白对照组基底动脉表达 ETRA，染色浓度很淡（图 1A） ；穿刺组、 盐水组基底动脉亦表达 ETRA，染色浓度淡，且各时间段免疫染色强度无明
17、显区别（图 1B1E） ；SAH 组脑血管 ETRA主要表达在血管内皮细胞、平滑肌细胞， ETRA在各时间段都有表达，但在 3 d时染色最重（图 1F1H）. 2.5 统计分析 SAH组基底动脉的周长在 5 d时缩小最强烈，此后会逐渐恢复，但 10 d时尚未恢复至正常（表 2） ，各亚组间比较，差异均有统计学意义（P0.05）. 盐水组基底动脉的周长在各时间段变化不明显. 穿刺组动物基底动脉的周长值为（81431） m，与盐水组比较无显著性差异，与 SAH组内 1h组比较无显著性差异，与 3 d，5 d，7 d，10 d组比较有显著性差异（P0.05）. 空白对照组动物的血管周长值为（8282
18、4） m，与盐水组比较无显著性差异，与 SAH组内 1 h组比较无显著性差异，与 3 d，5 d，7 d，10 d组比较有显著性差异（P0.05） ，与穿刺组比较无显著性差异.表 2SAH组和盐水组基底动脉周长统计分析（略） 3 讨论 目前大多数学者认为 SAH后 DCVS是一种超长时程的暂时不可复性血管舒缩功能改变，涉及到炎症反应等引起的器质性的改变. 当血液成分进入蛛网膜下腔使血管舒张 收缩因子平衡被打破，总的作用是使血管收缩，但发病机制仍然不清楚. ET是迄今为止发现的最强的血管收缩物3. ET1 是由 21个氨基酸残基组成的多肽，其缩血管作用是和ETRA特异性的结合后才发挥出来的. A
19、dner等4研究证明 ET1 和ET2 对豚鼠大脑中动脉产生强烈的浓度依赖性收缩，显示了大脑血管存在 ETA 受体，Zuccarello 等5的实验亦证实，SAH 引起的基底动脉收缩为 30%，该血管的改变可以被 ETRB1/B2拮抗剂所拮抗，使收缩减少到 10%. Nilsson等6实验测定了血管对 ET1 在用与不用受体阻断剂的情况下的反应，发现 ET1 可以诱发人大脑动脉浓度依赖性收缩，血管收缩可明显被 ETRA拮抗剂（Bosentan 和 FR139317）拮抗，此外在有和无内皮的人大脑动脉都可以探查到编码 ETRA和 ETRB的 mRNA，提示ET1 诱发人大脑动脉收缩主要由 ETR
20、A调节. Fernandez等7认为ET1 产生明显的脑血管收缩主要是激活 ETRA. 我们的实验结果表明：SAH 模型组在第 5日时其基底池和基底动脉周围的凝血块最为明显，在 10 d时已仅可见广泛的 SAH，凝血块已基本吸收. SAH 模型组第 5日的周长最小，且从 1 h至 7 d呈进行性下降趋势，在第 5日达到最低点，这个变化过程提示 SAH后在 3 d至 7 d是 CVS发生最严重的时期. 空白组、穿刺组和盐水组的基底动脉内 ETRA均有少量表达； 但 SAH组基底动脉内 ETRA却呈现强表达，在第 3日最强烈，主要分布在血管内皮细胞，平滑肌和外膜也有表达，到第 10日时 ETRA的
21、表达强度仍然较重. 正常脑血管本身就有 ETRA的表达，ETRA 可能在维持正常脑血管生理功能方面起到了重要的作用，但在病理状态下，ETRA 的过度表达可能导致脑血管痉挛的发生. 我们的结果初步表明：SAH 后脑血管内皮细胞ETRA的表达呈现明显的动态改变，ETRA 的表达在第 3日时最强烈；SAH 后 DCVS的发生开始于病程第 3日，但在病程第 5日最严重. 基底动脉 ETRA表达的变化趋势与其血管痉挛程度的变化过程并非完全同步，说明 SAH后 DCVS的发生机制非常复杂，很可能是多种因素共同作用的结果8-9. 但 SAH后脑血管 ETRA的高度表达可能在 DCVS的发病机制中起到重要的作
22、用. 基金项目：教育部高层次创造性人才计划新世纪优秀人才支持计划资助项目（NCET050831 ） 【参考文献】 1Shimoda M, Takeuchi M, Tominaga J, et al. Asymptomatic versus symptomaticinfarcts from vasospasm in patients with subarachnoid hemorrhage:seral magnetic resonance imagingJ. Neurosurgery, 2001, 49(6):1341-1350. 2Hansen SJ, Hoel NL, Zhou M. Sub
23、arachnoid hemorrhage enhances endothelin receptor expression and function in rat cerebral arteriesJ. Neurosurgery，2003, 52(5): 1188-1195. 3Yanagisawa M, Kurihara H, Kiumra S, et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelia cellsJ. Nature,1988,332(31):411-415. 4Adner M,Y
24、ou I, Edvinsson L. Characterization of endothelinA receptors in the cerebral circulationJ. Neuroreport, 1993, 4(4):441-443. 5Zuccarello M, Boccaletti R, Romano A, et al. Endothelin B rceptor antagonists attenuate subarachnoid hemorrhageinduced cerebral vasospasmJ. Stroke, 1998, 29(9):1924-1929. 6Nil
25、sson T, Cantera L, Adner M, et al. Presence of contractile endothelinA and dilatory endotheliaB rceptors in human cerebral arteriesJ. Neurosurgery, 1997, 40(2):346-353. 7Fernandez N, Monge I, Gareiavillalon AL, et al. Endothelin1 induced in vitro cerebral vasoconstriction is mediated by endothelin E
26、TA receptorsJ. Eur J pharmacol, 1995, 294(3):483-490. 8Nishizawa S, Nezu N, Uemura K. Direct evidence for a key role of protein kinase C in the development of vasospasm after subarachnoid hemorrhageJ. J Neurosurg, 1992, 76(4):635-639. 9Hansen SJ, Svensson CL, Xu CB, et al. Protein kinase mediated upregulation of endothelin A, endothelin B and 5hydroxytryptamine 1B/1D receptors during organ culture in rat basilar arteryJ. Br J Pharmacol, 2002, 137(1):118-126.
