1、受损背根节神经元持续性钠流的检测作者：刘志洋，王玉英，王文挺, 胡三觉 【关键词】 持续性钠流 【Abstract】 AIM: To detect persistent sodium current and to study its relationship with subthreshold membrane potential oscillation in injured DRG neurons. METHODS: Wholecell patchclamp experiments were performed with medium and small DRG neurons freshl
2、y isolated from rats. RESULTS: In the voltageclamp, DRG neurons with depolarizated membrane potential from -80 mV to -30 mV in ramp, produced a persistent sodium current for 150200 ms. The current with amplitude of 89200 pA was sensitive to 100 nmol/L TTX. In the currentclamp, when 100 nmol/L TTX wa
3、s added to the cells with subthreshold membranepotential oscillation (SMPO), the oscillation disappeared. CONCLUSION: The INap detected in the injured DRG neurons may be in some way responsible for the production of SMPO. 【Keywords】 ganglia, spinal; patchclamp techniques; persistent sodium current；
4、subthreshold membrane potential oscillation 【摘要】 目的： 检测损伤大鼠背根节（DRG）神经元持续性钠流（persistent sodium current， INap）并研究其与阈下膜电位振荡的关系. 方法： 术后 36 d慢性痛大鼠模型背根节急性分离，消化离散成单细胞，对中小型 DRG神经元运用全细胞膜片钳技术记录. 结果： 电压钳下，钳制电位在-80 mV，给予斜波去极化到-30 mV时，细胞产生一持续时间 150200 ms,幅值 89200 pA的持续性内向钠流，且对 100 nmol/L TTX敏感.电流钳下，产生阈下膜电位振荡的细胞，
5、给予 100 nmol/L TTX后，振荡消失. 结论： 在受损 DRG神经元上检测到的持续性钠流可能是产生阈下膜电位振荡的基础之一. 【关键词】 神经节，脊；膜片钳术；持续性钠流；阈下膜电位振荡 0 引言 外周感觉神经损伤以后，常伴随产生异常感觉，包括痛觉过敏现象.这些异常感觉主要由外周感觉神经的异位自发放电引起1.背根节（dorsal root ganglia, DRG）作为外周感觉信号传向中枢的第一站，担当异位自发放电“起搏点”的作用.异位自发放电的基础是阈下膜电位振荡（subthreshold membrane potential oscillation, SMPO） 2.但这种振荡的
6、离子基础还没有明确的说法.通过本实验的研究，在受损DRG神经元上，检测 INap及其与 SMPO产生的关系，有助于揭示异位自发放电产生的离子通道机制，为深入了解慢性痛信号产生的机制奠定基础. 1 材料和方法 1.1 材料 SD 大鼠 10 只，体质量 120150 g，雌雄不拘，由第四军医大学实验动物中心提供.胰蛋白酶（型） ，胶原酶（ 型） ，MgATP，CsF 购自Sigma 公司，其他试剂为国产. Axon 200A 放大器（美国 Axon 公司）. 1.2 方法急性分离背根节细胞后，进行全细胞膜片钳记录.实验在 30个 DRG细胞上记录，其中 25个中细胞和 5个小细胞.中细胞静息膜电
7、位为(-51.34.1) mV, 小细胞为(-48.53.4) mV. 1.2.1DRG 细胞的制备 SD大鼠在戊巴比妥钠（40 mg/kg, ip）麻醉下，制备 DRG慢性压迫模型，其制备方法参见文献3.术后 36 d，取制备好的动物模型，再用戊巴比妥钠麻醉，迅速取出 L4L5背根节，置于氧饱和的 M1640液中，镜下仔细剪除多余的神经纤维后，再剪碎神经节置于含酶的 M1640液 2 mL中（胰蛋白酶 0.375 g/L，胶原酶 1.125 g/L） ，37水浴消化 30 min后，加入胰酶抑制剂终止消化.置细胞于一次性培养皿中，用细胞外液灌流（1.5 mL/min） ，其配方如下（mmol
8、/L）： NaCl 150， KCl 5， MgCl2 1， CaCl2 5， Glucose 10， Hepes 10.细胞贴壁 1 h后进行电生理记录.依据细胞体积，DRG 细胞可分为大（直径40 m） 、中（直径 4030 m） 、小型（直径 30 m）分别对应于 A, A, A 及 C纤维细胞4-6.本文检测的 DRG细胞主要为中小型. 1.2.2 电压钳记录采用全细胞膜片钳方式记录.细胞电位钳制在-80 mV, 给以斜波去极化至-30 mV.电极电阻为 24 M,封接阻抗达到 1 G 以上.实验在室温下进行.电极内液配方（mmol/L）: CsF 140， EGTA 1， NaCl
9、10， Hepes 10，细胞外液配方（mmol/L）： NaCl 140， KCl 3， MgCl2 1， CaCl2 1， Hepes 10. 1.2.3 电流钳制电压钳模式下启动，先用电压钳模式完成高阻封接，后转向电流钳模式进行记录，记录内外液换成正常液体，电极内液（mmol/L）： K gluconate 140， MgCl2 2， EGTA 1.1, Hepes 10， MgATP 2，用 KOH调 pH值为 7.2左右.细胞外液配方（mmol/L）: NaCl 150， KCl 5， MgCl2 1, CaCl2 5， glucose 10， 10 Hepes，用 NaOH调 pH
10、值为 7.4左右.以上实验，封接电阻低于 1 G 的细胞或静息电位低于-40 mV，记录中电位衰减明显的细胞放弃.在此过程中，始终保持漏流在 100 pA以内. 统计学处理 ： 采用 pCLamp 6.0, Origin 6.0进行刺激和记录及数据获取和分析.数据均用 xsx . 2 结果 2.1 持续性钠流的引导成功封接的 30个 DRG细胞，给予斜波（-80 mV至-30 mV，时间 3 s）刺激，当去极化到-30 mV时，显示一内向持续电流.根据细胞大小不同，电流也有所不同.较大细胞有较大电流.幅值平均在（15040） pA. 引出的持续内向电流的时间跨度差别不是很大，中等细胞的持续时间
11、为（18020） ms，小细胞的持续时间为（16515） ms，平均电流持续时间为 150200 ms 之间（Fig 1）. 2.2 对 TTX的敏感性测出的持续性电流，在加入 100 nmol/L的TTX 2 min以后，电流幅值逐步减小，至 10 min后基本消失.当洗脱 TTX 10 min以后，持续性电流逐渐恢复其原来大小,说明这种电流对 TTX比较敏感（Fig 2）. 2.3 持续性电流与 SMPO的关系在电流钳记录模式下，给予细胞斜波(强度 200 pA,时间 1500 ms)刺激，引出 SMPO频率为（355） Hz，振幅为（125） mV.当加入 100 nmol/L TTX
12、5 min以后，振荡减小至消失，洗脱 TTX 8 min以后，振荡恢复（Fig 3）.说明该持续性电流可能介导 SMPO的产生. 3 讨论 我们在损伤 DRG神经元上记录到的这种持续内向电流，一是电压依赖性的，给予斜波刺激，去极化至-70 mV可激活引出，在-55 mV时达到最大值，比动作电位快钠通道的激活电位低 1020 mV.此种慢去极化电流可使介导动作电位的快钠通道失活. 二是记录到电流幅值较小，在89200 pA范围内，远远低于快钠电流，且对 110-9 mol/L TTX敏感.三是这种内向电流的持续时间较长，在 150200 ms之间.这些特征与其他神经元上报道的持续钠流结果一致7.
13、说明我们记录的是持续性钠流.产生病理性神经痛的关键之一是作为“起搏点”的 DRG神经元兴奋性异常增高，产生持久的异位自发放电，而这种自发放电的基础已经证明是 SMPO2.但产生这种振荡的离子通道机制还没有定论.有文献报道是TTX敏感钠通道的作用8 ，因为该振荡在胞外钠离子被替代或施与利多卡因/TTX 时消除.另外由持续性钠流介导的振荡在皮层神经元上也有报道9. 从我们的实验结果来看，这种内向电流对微量 TTX敏感，且阻断后不影响动作电位的产生，另外该种电流激活电压水平较低，且激活时间较长，幅值较小, 不被钙通道阻断剂 CdCl2阻断. SMPO在给予微量TTX后被消除.说明这是一种不同于快钠通
14、道的持续慢钠通道介导 SMPO的结果.由此，我们认为，慢性神经痛的产生可能和这种持续性钠流的存在有关，它在较低的电位处激活，介导产生 SMPO，当振荡总和叠加达到动作电位的阈值时，爆发动作电位，引起 DRG持续自发放电. 【参考文献】 1 Devor M, Seltzer Z. Pathophysiology of damaged nerves in relation to chronic pain A . Textbook of Pain M. London: Churchill Living, 1999:129-164. 2 Xing JL, Hu SJ, Jian Z, et al. S
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